武香玉，徐海燕，辛國(guó)芹，趙 影，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

乳桿菌作為動(dòng)物腸道的優(yōu)勢(shì)菌群之一，其對(duì)生物體的益生作用已被許多研究結(jié)果證實(shí)。而目前對(duì)乳桿菌特性的研究多限于乳品、植物等來(lái)源的乳桿菌，動(dòng)物源乳桿菌雖然也被應(yīng)用，但對(duì)其生物特性研究和篩選的報(bào)道卻不系統(tǒng)和全面。本試驗(yàn)以雞腸道黏膜為分離源分離乳酸菌并鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，以期為微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 分離源

泰安雞的腸道黏膜。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基：改良的MRS培養(yǎng)基，添加CaCO31%[1]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離篩選

初篩：健康雞解剖后無(wú)菌剪開(kāi)小腸，無(wú)菌棉拭子蘸取小腸黏膜黏液，將棉拭子置于無(wú)菌水（帶玻璃珠）中震蕩，將樣品充分打散混勻，取振蕩液依次稀釋至10-2、10-3、10-4，各稀釋度取0.1mL涂平板（MRS），2個(gè)重復(fù)，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分離純化菌株，4℃保藏備用。

復(fù)篩測(cè)定產(chǎn)酸性能，將分離的菌種以2%接種量接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液的pH。

1.2.2 菌種的鑒定

生理生化試驗(yàn)、分子鑒定（16S rRNA）[2-4]。PCR擴(kuò)增引物為 1492r 5'-ggttaccttgttacgactt-3'，27f 5'-agagttgatcctggctcag-3'。菌落PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，52℃退火1 min，72℃延伸2min，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)salt-free純化后，測(cè)序由博尚生物技術(shù)有限公司完成，要求雙向測(cè)通。將拼接后的序列結(jié)果輸入www.NCBI.nlm.nih.gov/blast，與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.3 菌株特性研究

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：以2%接種量將G-2-1接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，于0、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、32 h取樣測(cè)定pH以及活菌數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的活菌數(shù)與pH為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，找出最佳培養(yǎng)時(shí)間。

耐酸性試驗(yàn)：取發(fā)酵22 h的菌液，離心，棄上清，生理鹽水洗滌，加入生理鹽水5mL，鹽酸調(diào)節(jié)使其pH分別為2.0、3.0、4.0、5.5（對(duì)照），再定容至10mL，37℃培養(yǎng)2 h。平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率（%）。

耐膽鹽試驗(yàn)：在MRS培養(yǎng)基中加入豬膽酸鹽，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，不加膽鹽的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，菌液按1%的接種量接種，37℃培養(yǎng)30min。平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率（%）。

體外抑菌試驗(yàn)參照徐海燕等方法[5]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列作比對(duì)，采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

從5份雞樣品中分出14株在添加CaCO3的MRS平板上能夠有透明圈的菌株，各菌株發(fā)酵液pH見(jiàn)表1。由表1可以看出，14株菌產(chǎn)酸能力均較好，有13株菌的發(fā)酵液pH＜4，其中以G-2-1發(fā)酵液pH最低，為3.60。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

菌株G-2-1生理生化特征分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 G-2-1等菌株發(fā)酵液的pH

表2 G-2-1生理生化特性結(jié)果

菌株G-2-1的16S rRNA PCR電泳圖見(jiàn)圖1，條帶在1 000～2 000 bp，約為1 500 bp。由測(cè)序結(jié)果可知，其序列長(zhǎng)度為1 437 bp。其具體序列見(jiàn)圖2。

圖1 G-2-1PCR電泳圖

將圖2序列輸入www.NCBI.nlm.nih.gov/blast，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列作比對(duì)，進(jìn)行同源性分析，得到最相似的物種名，登錄號(hào)及其相似率，見(jiàn)表3。

圖2 菌株G-2-1的序列

表3 G-2-1的16S rRNA同源性比較

根據(jù)BLAST比對(duì)的結(jié)果初步鑒定G-2-1為L(zhǎng)actobacillus salivarius，然后從EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選相關(guān)模式菌株的16S rRNA序列，將G-2-1序列與模式菌株序列一起經(jīng)Clusta X1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用軟件MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，G-2-1與AF089108在1個(gè)分支，Bootstrap值為99，是可信的。因此將菌株G-2-1鑒定為唾液乳桿菌。

2.3 菌株特性試驗(yàn)研究結(jié)果

2.3.1 生長(zhǎng)曲線的繪制

生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，G-2-1約在4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，10 h后穩(wěn)定增長(zhǎng)，在20 h活菌數(shù)達(dá)最高26.5×108cfu·mL-1。G-2-1在進(jìn)入對(duì)數(shù)期后pH急劇降低，穩(wěn)定期時(shí)，pH較低，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。

2.3.2 耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

耐酸性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4結(jié)果可知，在pH＞3時(shí)G-2-1生長(zhǎng)良好，存活率菌＞100%，酸度對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)影響，可能會(huì)促進(jìn)其生長(zhǎng)，在pH 2.0時(shí)存活率為27.6%。

2.3.3 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌的另一個(gè)重要特征是對(duì)膽汁的耐受程度，乳酸菌要到達(dá)并定植于腸道，必須對(duì)膽鹽有一定的耐受性，對(duì)膽鹽的耐受程度決定了其在腸道中的存活能力。耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

圖3 菌株G-2-1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4 G-2-1的生長(zhǎng)曲線

表4 G-2-1的耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

表5 G-2-1在不同濃度膽鹽中的生長(zhǎng)情況

由表5結(jié)果可知，在膽鹽濃度＞0.2%時(shí)嚴(yán)重影響菌株生長(zhǎng)，存活率＜5.1%，膽鹽濃度0.1%時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)基本無(wú)影響，存活率達(dá)99.2%，G-2-1的耐膽鹽能力一般。

2.3.4 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑的大小測(cè)量G-2-1對(duì)致病菌的體外抑制程度，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 G-2-1的抑菌圈直徑mm

由表6可以看出，G-2-1對(duì)4種致病菌均有抑制作用，尤其是對(duì)大腸桿菌，抑制效果較好。這可能是營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生H2O2以及細(xì)菌素等多方面綜合作用的結(jié)果。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)以雞腸道黏膜為分離源分離篩選到一株產(chǎn)酸性能良好菌株G-2-1，結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特性分析以及16S rRNA基因序列分析，將此菌株鑒定為唾液乳桿菌。生物學(xué)特性試驗(yàn)研究結(jié)果表明，G-2-1具有良好的生物學(xué)特性，G-2-1在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛，20 h時(shí)活菌數(shù)＞109cfu·mL-1；耐酸效果良好；在膽鹽濃度為0.1%時(shí)存活率為99.2%；抑菌效果較好。

本試驗(yàn)篩選的雞源唾液乳桿菌是健康雞本身分離得到的菌株，耐酸好，對(duì)常見(jiàn)致病菌均有抑制作用，預(yù)期可作為微生態(tài)制劑用菌株，應(yīng)用效果有待于在研究和生產(chǎn)實(shí)踐中檢驗(yàn)。

[1] 張剛.乳酸細(xì)菌——基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007.

[2] 東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[3]雷正瑜.16SrDNA序列分析技術(shù)在微生物分類鑒定中的應(yīng)用[J].湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,4（1）:4-7.

[4] 武香玉,陳存社.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選鑒定[J].中國(guó)釀造,2009（9）:79-82.

[5] 徐海燕,曹斌,楊軍方.雞源嗜酸乳桿菌的篩選[J].中國(guó)飼料,2006（19）:32-34.