劉 學(xué)，薛亞平，柳志強(qiáng)，王亞軍，鄭裕國(guó)

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所 教育部生物轉(zhuǎn)化與生物凈化工程研究中心，杭州 310014)

(S)－鄰氯苯甘氨酸［(S)-2-chlorophenyl glycine］是一種具有生物活性的非天然氨基酸，同時(shí)也是合成新型抗血小板聚集藥物氯吡格雷的一種重要中間體［1］。氯吡格雷(Clopidogrel)是由法國(guó)Sanofi公司于1986年研制開發(fā)的新型的抗血小板凝聚藥物［2］。與傳統(tǒng)的抗血小板藥物阿司匹林、噻氯吡啶相比，氯吡格雷作用強(qiáng)度和耐受性大大增強(qiáng)，而副作用并沒有增高。在抗血栓藥物中，氯吡格雷市場(chǎng)占有率一路領(lǐng)先，是目前最暢銷的藥物之一［3］。近年來，氯吡格雷合成工藝主要是利用手性砌塊進(jìn)行不對(duì)稱合成技術(shù)［4］，其中(S)－鄰氯苯甘氨酸或(R)－鄰氯扁桃酸為主要的手性砌塊。因此，探索生物法制備光學(xué)純的(S)－鄰氯苯甘氨酸的途徑意義重大。

(S)－鄰氯苯甘氨酸及其甲酯制備傳統(tǒng)方法是化學(xué)拆分或不對(duì)稱合成方法，大多以D－樟腦磺酸［5－8］和 L － 酒石酸［9－12］為拆分劑，但拆分后得到的(S)－鄰氯苯甘氨酸光學(xué)純度不高，影響終端產(chǎn)物氯吡格雷的光學(xué)純度。生物催化法拆分具有選擇性高、收率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。目前，生物催化法拆分制備(S)－鄰氯苯甘氨酸的報(bào)道較多［13－17］。這些研究都有一定的不足，或是反應(yīng)條件苛刻(需無氮環(huán)境)，或是產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和選擇性不高等。而青霉素G酰化酶源易得，用來制備(S)－鄰氯苯甘氨酸的工藝較簡(jiǎn)單［18－19］，但國(guó)內(nèi)外這一方面的報(bào)道并不多。

青霉素G?；?penicillin G acylase，PGA)已經(jīng)適用于多種消旋氨基酸拆分，筆者擬在對(duì)青霉素G?；副磉_(dá)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以(R，S)－鄰氯苯甘氨酸為原料經(jīng)酰化得N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸，利用PGA催化拆分N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸制備(S)－鄰氯苯甘氨酸，未水解的N－苯乙酰－(R)－鄰氯苯甘氨酸進(jìn)行消旋化反應(yīng)生產(chǎn)成N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸繼續(xù)循環(huán)拆分。工藝路線如圖1所示。

圖1 重組青霉素G酰化酶催化法制備(S)－鄰氯苯甘氨酸Fig.1 Preparation of(S)-2-chlorophenylglycin using penicillin G acylase

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

菌種:重組枯草芽胞桿菌基因工程菌由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所構(gòu)建和保藏，該工程菌具有卡那霉素抗性標(biāo)記(Kanr)，重組菌不需誘導(dǎo)便能高效表達(dá)青霉素G?；?。

種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，卡那霉素 50 μg/mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上再添加各種C、N源進(jìn)行優(yōu)化。

1.2 儀器與材料

Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀，美國(guó)戴安公司;Bruker Avance III 500 MHz全數(shù)字化傅里葉超導(dǎo)核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司;Autopol IV魯?shù)婪蛉詣?dòng)旋光儀，美國(guó)魯?shù)婪蚬?恒溫培養(yǎng)振蕩器 NSKY，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司;Hei－VAP Advantage旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph公司;SHZ－88A往復(fù)式水浴恒溫振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司;DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南鞏義市予華儀器有限公司。

(R，S)－鄰氯苯甘氨酸、(S)－鄰氯苯甘氨酸，上海海曲化工有限公司;苯乙酰氯，上?，斠瘜W(xué)技術(shù)有限公司;其他試劑均為市售分析純。

1.3 菌體培養(yǎng)及比酶活、生物量的測(cè)定

1.3.1 菌體培養(yǎng)

從甘油管中取出保存的菌株，劃線接種于含卡那霉素的固體培養(yǎng)基平板上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約12 h，從平板上挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)液內(nèi)，37℃培養(yǎng)過夜。然后以2%接種量轉(zhuǎn)接到含有100 mL培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中。

1.3.2 酶活的測(cè)定

在50 mL具塞三角瓶中加入含10 mmol/L N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸的磷酸鈉緩沖液(100 mmol/L、pH 8.0)5 mL，于 30℃轉(zhuǎn)速為180 r/min水浴搖床上預(yù)熱5 min后，加0.2 mL發(fā)酵上清液，反應(yīng)6 min，取1 mL置于已加入20 μL 6 mol/L NaOH的 EP管中終止反應(yīng)，在12 000 r/min、4℃的條件下離心10 min，取上清液，用 HPLC檢測(cè)。

在30℃、pH 8.0條件下，每分鐘催化N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸生成1 μmol的(S)－鄰氯苯甘氨酸所需的酶量，即為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.3 生物量的測(cè)定

采用干質(zhì)量法，取一定體積的發(fā)酵液，將菌體離心收集后置于烘箱中，80℃烘干至恒質(zhì)量，每個(gè)樣平行3次。

1.4 N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸的制備

N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸的合成方法參照Fadnavis等［18］報(bào)道的方法。液相色譜測(cè)定產(chǎn)品純度為 99.36%，見圖 2。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ 13.10(s，1H)，8.95(s，1H)，7.48(s，1H)，7.37(s，2H)，7.28(s，5H)，7.22(s，1H)，5.79(s，1H)，3.56(s，2H)。

2 N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸高效液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of N-phenylacetic-(R，S)-2-chlorophenylglycine

1.5 酶法拆分 N－苯乙酰 －(R，S)－鄰氯苯甘氨酸

在500 mL錐形瓶中加入4.856 g N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸，再加入50 mL 2%氨水溶解，用2 mol/L鹽酸調(diào)pH至10.0，加入728 U青霉素G?；?發(fā)酵上清液40 mL)，補(bǔ)水定容到200 mL，在40℃、180 r/min水浴中水解反應(yīng)4 h。

1.6 分析方法

產(chǎn)物及底物濃度的檢測(cè)方法:采用HPLC法檢測(cè)。色譜柱為Hypersil ODS2－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，Elite，China);流速 0.7 ml/min;流動(dòng)相V(乙腈)∶V(0.1%高氯酸水溶液)=1∶1;檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30℃。(S)－鄰氯苯甘氨酸的保留時(shí)間是4.307 min，苯乙酸的保留時(shí)間是5.417 min，N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸的保留時(shí)間是6.470 min。

產(chǎn)物及底物濃度的手性檢測(cè)方法:用色譜柱為反相手性柱，Chirobiotic R手性柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，Sigma，USA)，流動(dòng)相 V(0.5% 乙酸)∶V(乙腈)=20∶80，流速 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 220 nm，進(jìn)樣量3 μL;柱溫30℃。N－苯乙酰－(S)－鄰氯苯甘氨酸的保留時(shí)間是3.127 min;N－苯乙酰－(R)－鄰氯苯甘氨酸的保留時(shí)間是3.713 min;(S)－鄰氯苯甘氨酸的保留時(shí)間是10.207 min;(R)－鄰氯苯甘氨酸的保留時(shí)間是12.350 min。

(S)－鄰氯苯甘氨酸的光學(xué)純度通過計(jì)算對(duì)映體過量值(e.e.)來評(píng)價(jià)，e.e.=［cS－ cR］/［cS+cR］×100%，其中，cS和cR為S型和R型異構(gòu)體的濃度;

酶的對(duì)映體選擇率(E)根據(jù)Chen等［20］的公式進(jìn)行計(jì)算，E=ln［1 － c(1+e.e.)］/ln［1 － c(1 －e.e.p)］，其中 e.e.為產(chǎn)物(S)－鄰氯苯甘氨酸的對(duì)映體過量值。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌表達(dá)PGA的SDS－PAGE電泳分析

重組枯草芽胞桿菌基因工程菌表達(dá)的PGA是由大小約為2.4×104的α－亞基和6.1×104的β－亞基形成的雜合二聚體。將重組菌發(fā)酵液離心制備上清液試樣，進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見清晰的PGA的α－亞基和β－亞基，表明重組枯草桿菌系統(tǒng)能夠?qū)⒈磉_(dá)的PGA分泌到細(xì)胞外。

圖3 上清液的SDS－PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of supernatant of recomibinant B.subtilis WB 800

2.2 重組菌表達(dá)PGA條件的優(yōu)化

2.2.1 C源對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

研究9種C源(葡萄糖、糊精、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、乳糖)對(duì)重組菌PGA表達(dá)的影響，結(jié)果見圖4。從圖4(a)可知:可溶性淀粉和糊精是較佳的產(chǎn)酶和菌體生長(zhǎng)C源，發(fā)酵液中PGA的比酶活分別達(dá)到11.98和11.52 U/mL，與對(duì)照(不添加C源)酶活7.34 U/mL相比，比酶活分別提高了163%和157%，而添加葡萄糖糖、山梨醇、甘油和甘露醇反而不利于PGA的表達(dá)，因此選擇可溶性淀粉作為菌株培養(yǎng)基的C源物質(zhì)。進(jìn)一步考察了不同濃度的可溶性淀粉對(duì)菌體生長(zhǎng)和PGA表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4(b)所示。發(fā)現(xiàn)當(dāng)可溶性淀粉質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，發(fā)酵液中PGA的酶活最高，繼續(xù)增加可溶性淀粉菌體濃度有所增大，但對(duì)PGA表達(dá)影響很小。選擇可溶性淀粉的濃度為10 g/L作為菌株后續(xù)優(yōu)化的C源濃度。

圖4 C源對(duì)菌體生長(zhǎng)及PGA表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of carbon sources on strain growth and PGA expression

2.2.2 N源對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

考察8種有機(jī)N源及其組合(酵母粉、蛋白胨、玉米漿、黃豆餅粉、牛肉膏、牛肉膏和蛋白胨、牛肉膏和酵母粉、蛋白胨和酵母粉)和4種無機(jī)N源(NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、尿素)對(duì)產(chǎn)酶和生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖5。由圖5(a)的結(jié)果可知:有機(jī)N源的效果要好于無機(jī)N源，在含有機(jī)N源的培養(yǎng)基中，菌體的生長(zhǎng)較好，產(chǎn)生的菌體量也多。以蛋白胨和酵母粉復(fù)配作為N源，發(fā)酵液中PGA比酶活達(dá)到12.58 U/mL，因此選擇了蛋白胨和酵母粉復(fù)配作為N源。進(jìn)一步考察了復(fù)合N源中不同蛋白胨/酵母粉比例對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響，如圖5(b)所示，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其比例為4∶1即12 g/L蛋白胨加3 g/L酵母粉時(shí)，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶均達(dá)到極大值。

圖5 不同N源對(duì)菌體生長(zhǎng)及PGA表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of nitrogen sources on strain growth and PGA expression

2.2.3 初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

研究了發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對(duì)重組菌生長(zhǎng)和PGA表達(dá)的影響，結(jié)果見表1。由表1可以看出:初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不大，但對(duì)菌株產(chǎn)酶影響較大。當(dāng)pH低于7.0時(shí)，PGA活力較低，初始pH在7.0～7.5范圍內(nèi)，菌株的PGA活力比較高，其中在pH 7.5時(shí)菌株的比酶活達(dá)到最高(13.04 U/mL)。pH繼續(xù)增大至弱堿性時(shí)，酶活力呈下降趨勢(shì)，因此培養(yǎng)該菌株時(shí)將培養(yǎng)基的初始pH調(diào)至7.5。

表1 初始pH對(duì)重組菌生長(zhǎng)和PGA表達(dá)的影響Table 1 Effects of initial pH on strain growth and PGA expression

2.2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

研究了培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和PGA活力的影響，選擇了25、28、30、34、37、40 ℃作為考察的溫度，結(jié)果見表2。發(fā)現(xiàn)溫度過低(25℃)不利于菌株的生長(zhǎng)，溫度在28～34℃范圍內(nèi)，菌體生長(zhǎng)良好但酶活偏低，且酶活都是隨著溫度的增大而增大，菌株在37℃條件下生長(zhǎng)最好，酶活最高，發(fā)酵液中酶活達(dá)13.76 U/mL。溫度進(jìn)一步升高，比酶活有降低趨勢(shì)，所以選擇培養(yǎng)溫度為37℃。

表2 溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和PGA表達(dá)的影響Table 2 Effects of temperature on strain growth and PGA expression

2.2.5 搖瓶裝液量對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

好氧微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要足夠的溶解氧來維持其生長(zhǎng)和代謝。發(fā)酵液的溶氧水平又受到搖床振蕩方式、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)基裝液量等的影響?？疾炝藫u床轉(zhuǎn)速為150 r/min、500 mL時(shí)的三角瓶中不同裝液量對(duì)生物量和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，溶氧水平對(duì)酶活有較大影響。當(dāng)裝液量為80 mL/(500 mL三角瓶)時(shí)，生物量和比酶活均達(dá)到極值，比酶活為13.9 U/mL，隨后裝液量繼續(xù)增加，PGA活力迅速下降。

圖6 搖瓶裝液量對(duì)菌體生產(chǎn)和產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of medium volume on strain growth and PGA activity

2.2.6 間歇培養(yǎng)過程中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線

發(fā)酵瓶接種后，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH、菌體濃度和比酶活等參數(shù)，結(jié)果見圖7。由圖7可知:在菌體培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液的pH隨培養(yǎng)時(shí)間的增加先略微下降再逐漸升高，可能因?yàn)樵趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體生長(zhǎng)過快，導(dǎo)致溶氧不足發(fā)生厭氧呼吸產(chǎn)生酸導(dǎo)致pH下降，后期隨著C源消耗完，利用N源釋放出氨及菌體自溶導(dǎo)致pH上升。發(fā)酵菌體生長(zhǎng)在15 h進(jìn)入穩(wěn)定期后，菌株產(chǎn)PGA水平顯著增加，說明PGA主要是在穩(wěn)定期完成加工成熟［21－22］，在28 h左右 PGA活力達(dá)到最高值18.23 U/mL，此時(shí)生物量也達(dá)最大5.5 g/L。隨后菌株進(jìn)入衰亡期，生物量和比酶活開始下降。因此發(fā)酵培養(yǎng)28 h為宜。

圖7 間歇培養(yǎng)過程中菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶時(shí)間曲線Fig.7 Time courses of cell growth and PGA activity in batch culture

2.3 酶促反應(yīng)條件的研究

2.3.1 酶促反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程

將4.856 g(80 mmol/L)N －苯乙酰 －(R，S)－鄰氯苯甘氨酸溶于20 mL 5%氨水中，用2 mol/L鹽酸調(diào)pH至10.0，加入728 U青霉素G酰化酶(發(fā)酵上清液40 mL)，補(bǔ)水定容到200 mL，在40℃，180 r/min水浴中反應(yīng)，定時(shí)取樣測(cè)定酶解產(chǎn)生的(S)－鄰氯苯甘氨酸?？疾旆磻?yīng)時(shí)間與產(chǎn)物(S)－鄰氯苯甘氨酸生成量的關(guān)系，結(jié)果見圖8。由圖8可知:在50 min以內(nèi)反應(yīng)速度較快，在50～180 min之間反應(yīng)速度減緩，在210 min以后(S)－鄰氯苯甘氨酸的濃度基本穩(wěn)定在39.88 mmol/L，酶促反應(yīng)時(shí)間以3.5～4 h為宜，N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.85%。同時(shí)用反相手性柱分析了產(chǎn)物的光學(xué)純度，e.e.p大于 99.9%，對(duì)映體選擇性大于200。該酶具有高度的立體選擇性，適用于制備高光學(xué)純的(S)－鄰氯苯甘氨酸。

圖8 酶促反應(yīng)過程與底物、產(chǎn)物濃度的變化趨勢(shì)Fig.8 Effects of enzymatic reaction time on substrate and product concentration

2.3.2 底物濃度對(duì)酶法拆分的影響

在pH為10條件下，加酶量為18 U青霉素G?；?1 mL發(fā)酵液上清)，5 mL反應(yīng)體系中，改變底物N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸濃度(30～160 mmol/L)，在恒溫40℃水浴中反應(yīng)，在6 min測(cè)初速度，4 h測(cè)定反應(yīng)轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物e.e.值，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知:當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?20 mmol/L時(shí)，酶促反應(yīng)的初速率隨著底物濃度的增大而增大，在底物濃度為120 mmol/L時(shí)，達(dá)到最大反應(yīng)初速率17.74 μmmol/(min·mg)，繼續(xù)增大底物濃度時(shí)反應(yīng)的初速率隨之下降，這可能是由底物對(duì)酶的抑制作用引起的。在底物濃度小于90 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率接近50%，但是產(chǎn)物量偏低，沒有工業(yè)化優(yōu)勢(shì)。繼續(xù)增大底物濃度，轉(zhuǎn)化率降低，在底物濃度為100 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到 44.2%。另外產(chǎn)物 e.e.值始終保持在99.9%以上，可見該酶的對(duì)映體選擇性不受底物濃度影響。

圖9 底物濃度對(duì)初速率、轉(zhuǎn)化率及e.e.p值的影響Fig.9 Effects of substrate concentration on conversion，initial rate and e.e.p

2.4 (S)－鄰氯苯甘氨酸的制備

N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸4.856 g溶于5%氨水中，HCl調(diào)pH至10.0，加40 mL酶液，補(bǔ)水定容到200 mL，40℃、180 r/min水浴中反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液65℃減壓濃縮至50 mL，置于冰浴中，用6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，有大量白色沉淀析出。抽濾，烘干得N－苯乙酰－(R)－鄰氯苯甘氨酸和苯乙酸的混合物3.3 g。剩余濾液加入乙酸乙酯(3×20 mL)萃取出剩余的微量的苯乙酸。濾液調(diào)pH至7.0，減壓蒸干得白色固體，再溶解于熱異丙醇去除鹽，旋轉(zhuǎn)蒸干得(S)－鄰氯苯甘氨酸1.4 g，收率94.29%(以起始原料N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸的0.5倍摩爾量計(jì))。［α］=+90(c 1，1 mol/L HCl)，文獻(xiàn)值［18］［α］=+89(c 1，1 mol/L HCl)。e.e.p大于99.9%。1H NMR(500 MHz，D2O)δ 7.52(d，J=8.0 Hz，1H)，7.50 ～7.34(m，3H)，5.15(s，1H)。

2.5 N－苯乙酰－(R)－鄰氯苯甘氨酸的消旋

將上述N－苯乙酰－(R)－鄰氯苯甘氨酸與苯乙酸的混合物置于圓底燒瓶中，油浴加熱至170℃共熔消旋15 min，置于冷水進(jìn)行冷卻，取樣溶于甲醇，測(cè)旋光度為0，消旋率100%。共熔消旋物用熱環(huán)己烷萃取3次(3×100 mL)除去苯乙酸，固體烘干的得到N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸2.3 g，提取收率94.73%。

3 結(jié)論

在優(yōu)化后培養(yǎng)條件下，可溶性淀粉10 g/L、蛋白胨12 g/L 、酵母粉3 g/L、NaCl 10 g/L;pH 7.5、培養(yǎng)溫度37℃、裝液量80 mL(500 mL三角瓶)，發(fā)酵28 h后發(fā)酵液的青霉素G?；让富钸_(dá)到18.23 U/mL，相比于優(yōu)化前比酶活提高了2.48倍。利用重組枯草芽胞桿菌分泌表達(dá)的青霉素G?；敢翰鸱种苽?S)－鄰氯苯甘氨酸，收率94.29%，e.e.p大于99.9%。N－苯乙酰－(R)－鄰氯苯甘氨酸與苯乙酸共熔消旋為N－苯乙酰－(R，S)－鄰氯苯甘氨酸，收率達(dá)94.7%，可繼續(xù)用于循環(huán)拆分。該法具有制備工藝簡(jiǎn)單、催化效率高、環(huán)境友好、立體選擇性強(qiáng)、發(fā)酵成本低等特點(diǎn)，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，后期可以考慮將酶進(jìn)行固定化，以提高酶的使用效率，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。

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