趙東旭，羅愛芹，李 春，張建麗，周曉宏，楊新芳

在高等教育過程中，實驗教學(xué)對于促使學(xué)生加強對書本知識的理解、掌握基本的實驗設(shè)計方法和操作技能、增強感性認(rèn)識、貫徹系統(tǒng)性實踐的能力等，具有不可替代的作用，應(yīng)該受到更多的重視，加強新型交叉學(xué)科生物工程專業(yè)學(xué)生的實踐創(chuàng)新能力更是迫在眉睫［1－2］。生物分離工程課程是生物工程專業(yè)的必修基礎(chǔ)課程，生物分離工程的實驗環(huán)節(jié)不同于傳統(tǒng)的化工分離操作，其在上游生物工程、發(fā)酵技術(shù)的基礎(chǔ)上，從濃度稀、成分復(fù)雜、物料不穩(wěn)定的料液開始操作，整個生物分離過程包括材料預(yù)處理和固液分離、初步純化、高度精制和成品制作四大單元操作。分離工藝經(jīng)過不同批次的條件摸索后，即可用于放大生產(chǎn)。生物分離過程集現(xiàn)代生命科學(xué)和工程設(shè)計學(xué)為一體，重復(fù)性強、步驟多、交叉性明顯、應(yīng)用性強。

1 現(xiàn)代生物分離工程綜合性實驗設(shè)計的必要性

生物工程已經(jīng)作為一級學(xué)科列入國務(wù)院學(xué)位辦下發(fā)的學(xué)科目錄，表明現(xiàn)代生物技術(shù)在國民經(jīng)濟建設(shè)中的作用愈來愈受到重視。生物分離工程（有時也稱作生化分離工程，bio－separation）是生化工程的一個重要組成部分，它是描述回收生物產(chǎn)品分離過程原理和方法的一個術(shù)語。生化分離工程是生物技術(shù)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力所不可缺少的重要環(huán)節(jié)，為突出其在生物技術(shù)領(lǐng)域中的地位和作用，常稱它為生物技術(shù)下游加工過程（down－stream processing）。傳統(tǒng)上的生物分離工程是作為生物工程或生物技術(shù)進入實際應(yīng)用的必須后續(xù)技術(shù)之一。最新的發(fā)展趨勢表明，生物分離工程或?qū)⒆鳛楝F(xiàn)代生物工程的重要研究方向之一，與“細胞培養(yǎng)與代謝工程”、“生物催化與轉(zhuǎn)化工程”、“合成生物技術(shù)與系統(tǒng)生物工程”、“生物藥物與材料工程”、“生物資源與環(huán)境工程”等共同發(fā)展。作為重要的工科課程，同時也作為生物工程專業(yè)的重要基礎(chǔ)課程，關(guān)于其理論課的教學(xué)探討已有較多的討論［3－6］，甚至有學(xué)者提出了“研究型”教學(xué)的模式［7－8］，但是在其實踐環(huán)節(jié)的綜合性實驗方面的討論還有待深入。生物分離工程實驗教學(xué)是整個教學(xué)計劃中的有機部分，它具有鞏固和加深學(xué)生所學(xué)的理論知識，使學(xué)生獲得生產(chǎn)知識、培養(yǎng)學(xué)生實際工作能力的功能。學(xué)生動手能力的培養(yǎng)不在于一定要發(fā)現(xiàn)新的生物分離技術(shù)，爭創(chuàng)專利，而是學(xué)生在現(xiàn)有的知識、能力的基礎(chǔ)上，能夠創(chuàng)造性地解決問題［9－10］。為提高學(xué)生的綜合性、工程性創(chuàng)新能力，有必要將相對分散的課程體系提煉出一個系統(tǒng)性強的綜合性實驗體系，同時也是強化與改革現(xiàn)有的實踐教學(xué)環(huán)節(jié)的具體體現(xiàn)。本文將以天花粉蛋白的提取和純化過程為例，根據(jù)現(xiàn)代生物工程的學(xué)科特點和實際生產(chǎn)過程中的單元操作安排，設(shè)計出從原料提取到純度鑒定的實驗框架。

2 現(xiàn)代生物分離工程設(shè)計的理念

現(xiàn)代生物分離工程涉及到很多的分離技術(shù)，在設(shè)計理念上應(yīng)該堅持以下原則：

（1）體現(xiàn)系統(tǒng)性。以某一蛋白為模型蛋白，內(nèi)容包括原材料的預(yù)處理技術(shù)、破碎技術(shù)、初步提取技術(shù)、高度純化（精制）技術(shù)、純度鑒定技術(shù)等內(nèi)容。

（2）工程性。將全部的實驗操作完全按照工業(yè)生產(chǎn)的單元操作進行劃分，分成若干個工藝段。

（3）目標(biāo)產(chǎn)物明顯。通過制得一定量的產(chǎn)物來體現(xiàn)所用的分離技術(shù)的可行性，同時也可以提升學(xué)生的“成就感”和興趣。

目前，以水溶性蛋白或酶為目標(biāo)蛋白的制備過程，是生命科學(xué)實驗室中最為常見的操作，其中基本上全部用到了最為常見的分離技術(shù)，如針對動植物組織的組織破碎或高壓壓榨技術(shù)，實現(xiàn)液固分離的離心技術(shù)、過濾技術(shù)，可對大體積樣品進行快速濃縮并且有初步純化作用的鹽析技術(shù)和吸附技術(shù)，可對樣品進行高度純化的各種層析技術(shù)等。離子交換層析是一種特殊的吸附層析，基本上是一種必不可少的手段。對于蛋白純度檢測來說，尺寸排阻層析和SDS－PAGE（SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳）是2種最為普遍的手段。對終產(chǎn)品的加工技術(shù)主要包括超濾濃縮、冷凍干燥技術(shù)等。因此，在綜合性分離工程實驗設(shè)計上，應(yīng)該包括上述全部技術(shù)，或至少是絕大部分技術(shù)。本文將以傳統(tǒng)中藥天花粉蛋白為模型蛋白，設(shè)計其分離純化的技術(shù)路線。

3 以天花粉蛋白為模型的綜合性生物分離工程的實驗設(shè)計及應(yīng)用

天花粉是一種傳統(tǒng)中藥，來自于栝樓的塊根，傳統(tǒng)上一般用于終止妊娠反應(yīng)。研究表明，其生物學(xué)活性物質(zhì)是其含有的天花粉蛋白，而且，最近的研究表明，天花粉蛋白具有明顯的抗腫瘤作用。該蛋白分子量27kD，pI9.4（pI即等電點，絕大多數(shù)蛋白的pI在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)）。本文將根據(jù)上述原則，以天花粉為原料，提出對其中富含的天花粉蛋白進行提取、分離和純度鑒定的實驗框架［11－13］。

3.1 操作單元1：原料處理

主要操作包括：

（1）原材料的預(yù)處理；

（2）天花粉的粉碎及效果評價；

（3）活性炭吸附（脫色處理）。

在原料預(yù)處理環(huán)節(jié)，主要實驗內(nèi)容包括：去除粘附在塊根上的泥土、清洗、晾干、去皮及稱重、粉碎機（或勻漿機）的多次破碎、大容量低速離心機沉淀未徹底破碎的組織及淀粉粒等、高速冷凍離心機實現(xiàn)較徹底的固液分離以得到真溶液（提取液）、活性炭吸附以脫去色素成分、分光光度計比色方法初步評判破碎效果和所需破碎次數(shù)。

需要探索的技術(shù)參數(shù)包括：

（1）原料與提取液的比例；

（2）破碎次數(shù)；

（3）1g活性炭吸附提取液的量或100g原料所需活性炭量（g）；

（4）吸附過程的流速等。

3.2 操作單元2：初步純化

主要操作包括：

（1）合適鹽析條件的確定；

（2）大量提取液的處理——鹽析技術(shù)；

（3）透析脫鹽方法；

（4）凍干處理方法。

在初步純化環(huán)節(jié)，主要實驗內(nèi)容包括：利用小體積溶液進行硫酸銨20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%飽和度鹽析并配合SDS－PAGE檢測，確定鹽析技術(shù)對天花粉蛋白的初步純化，同時為實現(xiàn)對大體積提取液的濃縮摸索條件；大量提取液的鹽析操作、低溫透析操作及凍干操作，以便對高含量比的混合物進行較長時間保存、SDS－PAGE操作。

需要探索的技術(shù)參數(shù)包括：

（1）合適鹽析范圍，既保證最大限度地去除雜質(zhì)，又可在最低鹽用量時回收最多的目標(biāo)蛋白；

（2）比較理想的PAG濃度，以得到理想的電泳圖。

3.3 操作單元3：高度純化（精制）

主要操作包括：

（1）pH階段梯度洗脫方式的陽離子交換層析；

（2）鹽離子線性梯度洗脫方式的陽離子交換層析；

（3）飽和進樣時的階段梯度洗脫方式的陽離子交換層析；

（4）尺寸排阻層析進一步純化天花粉蛋白。

在高度純化（精制）環(huán)節(jié)，主要實驗內(nèi)容包括：根據(jù)天花粉蛋白在中性pH條件下帶正電荷的性質(zhì)，在pH 8時進行吸附，可將大部分雜蛋白去除，改變pH再去除pI低于9.4的一些雜蛋白，再用高pH緩沖液洗脫即可得到較純的目標(biāo)蛋白溶液。充分使用了目標(biāo)蛋白pI為9.4的特點。鹽離子線性梯度洗脫方式也是一種最為普通的洗脫方式，常用的鹽離子濃度范圍一般是0～0.5mol/L NaCl。常用的梯度儀有2個形狀完全相同，且底部有細管道相連的同水平放置的容器組成，高效液相層析系統(tǒng)則由電腦控制的柱塞泵組成，精確度更高。飽和進樣操作也是一種基本操作，可以高效利用層析系統(tǒng)。尺寸排阻層析既是一種最后的純化手段，也是一種純度鑒定技術(shù)，操作過程相對簡單些。

需要探索的技術(shù)參數(shù)包括：

（1）合適的pH梯度；

（2）在給定層析柱條件下，鹽梯度洗脫時的體積及洗脫速度；

（3）尺寸排阻層析的進樣量及洗脫速度等。

3.4 操作單元4：成品加工

主要操作包括：

（1）超濾濃縮；

（2）冰凍干燥處理。

在對末端產(chǎn)物的加工環(huán)節(jié)，主要實驗內(nèi)容包括：

（1）利用超濾濃縮技術(shù)對大體積的含有目標(biāo)產(chǎn)物的溶液進行濃縮，達到合適的濃度；

（2）利用冰凍干燥機對上述樣品進行凍干并分裝保存。

需要探索的技術(shù)參數(shù)包括：

（1）在選定截留一定分子量蛋白的超濾后，探索合適的過膜壓力和濃縮倍數(shù)；

（2）在給定容器和樣品體積條件下，探索凍干所需的大致時間。

3.5 操作單元5：純度鑒定

主要操作包括：

（1）分析型尺寸排阻層析技術(shù)；

（2）SDS－PAGE方法。

在純度鑒定環(huán)節(jié)，主要實驗內(nèi)容包括：

（1）分析性尺寸排阻層析對目標(biāo)樣品的分析，根據(jù)出峰情況初步斷定樣品的純度，該操作需要用到高效液相層析系統(tǒng)；

（2）利用SDS－PAGE方法檢測樣品中蛋白單體/亞基的組成，該操作是普通生物化學(xué)實驗室里的常規(guī)操作，通過與分析性尺寸排阻層析的比較來斷定樣品的純度。

需要探索的技術(shù)參數(shù)包括：

（1）給定尺寸排阻層析柱時，不同的流動相的選擇以及進樣體積的范圍；

（2）SDS－PAGE操作時，合適的凝膠濃度。

根據(jù)上述操作，需要得到的結(jié)果匯總到簡表（表1）中，以指示實驗進度。

表1 不同操作環(huán)節(jié)的蛋白回收情況比較（空白表）

3.6 應(yīng)用

我們將上述實驗設(shè)計的內(nèi)容作為我校2010級和2011級研究生課程“高等生物分離工程”的實驗部分，選課學(xué)生包括“化學(xué)工程與技術(shù)”學(xué)科及“生物學(xué)”學(xué)科的100多位碩士研究生（含少量博士生），加深了學(xué)生對現(xiàn)代生物分離工程系統(tǒng)性、工程性的認(rèn)識，取得了預(yù)期的訓(xùn)練效果。

4 結(jié)束語

通過生物分離工程綜合性實驗的設(shè)計和在我校2010級和2011級相關(guān)專業(yè)研究生的具體實踐，達到了我們的預(yù)期目標(biāo)，同時在實踐中也對具體的實驗過程進行了完善。這項工作的進一步改進，將會更加有利于生物工程類研究生（含本科生）的教育教學(xué)。

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