寧宇　李蕾　苗永美　李季　陳勁楓

摘 要： 以黃瓜品種長春密刺子葉節(jié)為外植體，研究了乙酰丁香酮（AS）的添加方式、濃度及共培養(yǎng)pH對黃瓜遺傳轉化的影響。結果表明：在侵染菌液和共培養(yǎng)基中加入AS均可顯著提高黃瓜抗性芽誘導率，濃度以100 μmol·L-1為最佳。共培養(yǎng)基的pH 對黃瓜抗性芽誘導率也有影響，其中在pH 5.2的共培養(yǎng)基上黃瓜轉化率最高。研究結果優(yōu)化了黃瓜遺傳轉化體系，提高了黃瓜轉化效率，為推動黃瓜轉基因工作奠定了堅實的基礎。

關鍵詞： 黃瓜； 遺傳轉化； 乙酰丁香酮； pH

黃瓜（Cucumis sativus L.）是一種重要的經(jīng)濟作物，在全世界范圍內有較大的種植面積。黃瓜遺傳基礎狹窄，種質資源較少，很多重要的遺傳性狀無法通過有性雜交的手段來改良。因此，基因工程技術就成為對常規(guī)育種的有效補充手段。農(nóng)桿菌介導的子葉節(jié)法是黃瓜轉基因中最為常用的方法[1]，目前已通過這種方法將iaaM[2]、BnCS[3]及opd[4]等基因轉入到黃瓜當中。但目前這種方法應用的最大瓶頸是黃瓜的再生困難、轉化效率低，因此如何提高黃瓜的轉化率，建立穩(wěn)定、高效的轉化體系是黃瓜遺傳轉化過程中急需解決的問題。

乙酰丁香酮（AS）是宿主細胞分泌出的一種酚類化合物，它可以通過增強農(nóng)桿菌的侵染效果來提高基因的轉化效率。目前在水稻[5]、辣椒[6]及楊樹[7]等多種作物的基因轉化過程中都會添加一定濃度的AS來提高轉化效率。AS的作用效果受多種因素的影響，如植物種類、AS的添加方式和濃度、菌株和載體類型、共培養(yǎng)pH及對AS產(chǎn)生協(xié)同作用的物質等[8]。其中AS的添加方式和濃度及共培養(yǎng)pH是較為重要的3個因素，探討這三者對黃瓜轉化率的影響對于優(yōu)化黃瓜遺傳轉化體系具有十分重要的意義，而目前這方面的研究還未見報道。

本文以黃瓜品種長春密刺為試材，就AS的添加方式、濃度及共培養(yǎng)pH對黃瓜遺傳轉化效率的影響進行了探討，以明確AS在黃瓜遺傳轉化過程中的使用條件和方法及最佳共培養(yǎng)pH，建立穩(wěn)定、高效的黃瓜遺傳轉化體系，為提高黃瓜轉化效率、推動黃瓜轉基因工作的前進奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 南京農(nóng)業(yè)大學葫蘆科作物遺傳與種質創(chuàng)新實驗室保存的華北型黃瓜長春密刺的高代自交系。

1.1.2 菌株和質粒 所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105（Rif R，Kan R），由本實驗室保存和提供。植物表達載體pCAMBIA1304-CsCBF3由本實驗室構建，載體上攜帶標記基因HYG（潮霉素）、目的基因CsCBF3[9]、GUS基因、GFP基因，CaMV35S啟動子及NOS終止子，圖譜如圖1所示。

圖1 植物表達載體pCAMBIA1304-CsCBF3的

T-DNA區(qū)圖譜

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌-子葉節(jié)法轉化黃瓜 試驗于2012年3月在南京農(nóng)業(yè)大學進行。選取飽滿的長春密刺種子，在0.1% 的升汞溶液中消毒滅菌8 min，無菌水沖洗4～6次后用濾紙吸干表面水分，然后接種在MS培養(yǎng)基上。（25±2）℃ 條件下暗培養(yǎng)2 d后轉至光下繼續(xù)培養(yǎng)，4～5 d后切取子葉節(jié)，接種在預培養(yǎng)基上黑暗中預培養(yǎng)2 d。

挑取攜帶表達載體pCAMBIA1304-CsCBF3的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種于YEB+50 mg·L-1 Kan+50 mg·L-1 Rif液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下震蕩培養(yǎng)16 h。離心后棄去上清液，加入MS0液體培養(yǎng)基重懸至OD600為0.6作為侵染液。將經(jīng)過預培養(yǎng)的黃瓜子葉節(jié)置于MS0農(nóng)桿菌菌液中侵染10 min，吸干菌液后接種在共培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d后轉接至選擇培養(yǎng)基上，每2周繼代培養(yǎng)1次。

1.2.2 乙酰丁香酮處理 1）侵染菌液中加入乙酰丁香酮：在MS0農(nóng)桿菌菌液中加入乙酰丁香酮，使終濃度分別為0、50、100、150、200 μmol·L-1，低速震蕩培養(yǎng)1 h以活化農(nóng)桿菌，然后將其作為侵染菌液用于侵染，每處理3次重復。2）共培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮：試驗采取兩因素正交設計，將共培養(yǎng)基pH分別設為4.9、5.2、5.5、5.8，在每個pH水平上分別添加乙酰丁香酮至終濃度分別為0、50、100、150、200 μmol·L-1，以未添加AS的MS0農(nóng)桿菌菌液為侵染液，每處理3次重復。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 抗性芽在選擇培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，繼代2～3次（選擇培養(yǎng)30 d）后統(tǒng)計長芽外植體數(shù)與總外植體數(shù)。將抗性芽誘導率（用產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù)與總外植體數(shù)的比值的百分率表示）作為評價黃瓜轉化率的指標。利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行均值、標準差計算及顯著性方差分析。

2 結果與分析

2.1 侵染菌液中添加AS對黃瓜轉化效率的影響

將預培養(yǎng)2 d的黃瓜子葉節(jié)浸至于添加了不同濃度乙酰丁香酮的菌液當中侵染，侵染后先在共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d，然后接種在選擇培養(yǎng)基上篩選，30 d后統(tǒng)計抗性芽誘導率。結果表明（表1），與對照相比，侵染菌液中添加AS可顯著的提高黃瓜抗性芽誘導率。隨著其濃度的增加，抗性芽誘導率也隨之升高，濃度為100 μmol·L-1時達到最高。若AS濃度繼續(xù)增加，誘導率反而下降。說明在侵染菌液中加入AS可有效提高黃瓜的轉化率，但濃度不宜過高，以100 μmol·L-1為最佳。

表1 菌液中添加乙酰丁香酮對

抗性芽誘導率的影響

[注] 大寫字母表示差異極顯著（P<0.01），小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。下同。

2.2 共培養(yǎng)基中不同AS濃度與pH組合對黃瓜轉化效率的影響

將預培養(yǎng)2 d的黃瓜子葉節(jié)浸至于未添加乙酰丁香酮的菌液中侵染，侵染后接種在不同濃度AS和pH組合的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，然后轉至選擇培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計總外植體數(shù)和長芽外植體數(shù)，計算抗性芽誘導率（表2）。結果表明，不同濃度的AS和不同共培養(yǎng)基pH的配合使用對黃瓜抗性芽誘導率有顯著影響。在不同的組合當中，在不添加AS的pH為4.9或5.8的共培養(yǎng)基上獲得的抗性芽誘導率最低，均為13.33%。而在pH為5.2的共培養(yǎng)基上添加100 μmol·L-1的AS時獲得的黃瓜抗性芽誘導率最高，達到44%，因此，該組合可作為黃瓜轉化過程中最適的共培養(yǎng)條件。

2.3 共培養(yǎng)基中AS濃度對黃瓜轉化效率的影響

從表3可以看出，乙酰丁香酮濃度單因素的F值達到了極顯著的水平，說明共培養(yǎng)階段AS濃度對黃瓜抗性芽誘導率有極大的影響，因此本研究將其作為主效應因子就其對黃瓜轉化率的影響規(guī)律進行了分析。結果表明（表4），與不添加AS的對照相比，共培養(yǎng)基中添加AS可顯著提高黃瓜抗性芽誘導率。在本研究所設的AS濃度范圍內，隨著濃度的增加，黃瓜抗性芽誘導率也不斷升高，并且在濃度為100 μmol·L-1時達到最大，為38.05%。但隨著AS濃度繼續(xù)升高，誘導率反而降低，原因可能是AS配制時一般使用二甲基亞砜（DMSO）溶解，而二甲基亞砜有劇毒，濃度過高抑制了農(nóng)桿菌的生長。

表4 共培養(yǎng)基中乙酰丁香酮濃度對

抗性芽誘導的影響

2.4 共培養(yǎng)pH對黃瓜轉化效率的影響

共培養(yǎng) pH 的高低也會影響農(nóng)桿菌的侵染效果，為探索黃瓜轉化過程中最適的共培養(yǎng)pH，將其作為主效應因子對其進行分析。統(tǒng)計結果顯示（表5），不同共培養(yǎng)pH條件得到的黃瓜抗性芽誘導率不同。當pH為5.8時，黃瓜抗性芽誘導率最低，僅為22.59%。而pH為5.2時黃瓜抗性芽誘導率最高，為31.65%，但與共培養(yǎng)pH為5.5時的誘導率差異并不顯著。因此可得出結論，pH為5.2～5.5的共培養(yǎng)基較適宜黃瓜轉化。

3 討 論

乙酰丁香酮是一種酚類化合物，其主要作用機理是通過誘導農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的活化和表達，將T-DNA區(qū)從T兩側25 bp邊緣序列中切割下來，促進了DNA的轉移，使農(nóng)桿菌T-DNA更易進入植物基因組并與其整合[10]。根據(jù)乙酰丁香酮的作用機理在使用過程中一般分為菌液中添加、共培養(yǎng)基中添加以及在菌液和共培養(yǎng)基中共同添加3種方法，如在藍豬耳遺傳轉化時在根癌農(nóng)桿菌菌液中加入100 μmol·L-1乙酰丁香酮，可使轉化芽誘導率從5.76%提高到12.1%[11]；在研究杉木轉基因時，在共培養(yǎng)基中加入80 μmol·L-1乙酰丁香酮，Kan抗性芽的產(chǎn)生頻率比對照有了明顯提高[12]。當然，還有一些其他有效利用乙酰丁香酮的方法，如在甘薯外植體傷口處滴加乙酰丁香酮也可顯著提高抗性芽獲得率[13]。本研究分別在侵染菌液和共培養(yǎng)基中添加了一定濃度的乙酰丁香酮，結果表明，與對照相比，這2種方法均可顯著提高黃瓜抗性芽的誘導率。

在遺傳轉化過程中，不同物種的最適乙酰丁香酮濃度也不盡相同。在黃柏遺傳轉化時加入60 μmol·L-1乙酰丁香酮轉化率最高[14]，向日葵遺傳轉化共培養(yǎng)基中加入100 μmol·L-1乙酰丁香酮最有利于提高轉化率[15]，而丹參遺傳轉化共培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的最適濃度為400 μmol·L-1[16]。本文對黃瓜最適的乙酰丁香酮濃度進行了探索，發(fā)現(xiàn)加入100 μmol·L-1的乙酰丁香酮可大幅提高黃瓜抗性芽的誘導率。

pH值的高低對乙酰丁香酮的誘導效果也有著明顯的影響，從理論上講，含乙酰丁香酮的培養(yǎng)基pH為5.0～5.5時，乙酰丁香酮的誘導效果較好。前人研究表明[17]，乙酰丁香酮在pH值5.2的條件下轉化效果最好。本文研究了pH值對黃瓜遺傳轉化的影響，試驗結果表明共培養(yǎng)pH 5.2時黃瓜的抗性芽誘導率最高，但其對于黃瓜抗性芽誘導率影響并不顯著。

本文對黃瓜遺傳轉化過程中乙酰丁香酮的使用進行了較為系統(tǒng)的研究，進一步優(yōu)化了黃瓜的遺傳轉化體系，為推動黃瓜轉基因工作的前進奠定了堅實的基礎。

參考文獻

[1] 侯愛菊，朱延明，楊愛馥，等. 誘導黃瓜直接器官發(fā)生主要影響因素的研究[J]. 園藝學報，2003，30（1）： 101-103.

[2] 蘇紹坤，劉宏宇，秦智偉. 農(nóng)桿菌介導iaaM基因黃瓜遺傳轉化體系的建立[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報，2006，37（3）： 289-293.

[3] 劉文萍，盧淑雯，劉建新，等. 農(nóng)桿菌介導的BnCS基因對黃瓜遺傳轉化研究[J]. 北方園藝，2009（1）： 20-22.

[4] 趙杰宏，韓 潔，趙德剛. 轉基因表達有機磷水解酶（OPH）提高黃瓜降解蠅毒磷能力的初步研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2010，26（1）：182-186.

[5] Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al. Efficient transformation of rice（Oryza satova L.）mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of T-DNA[J]. The Plant Journal，1994，6（2）： 271-282.

[6] Kim S，Kim S R，An C S，et al. Constitutive expression of rice MADS box gene using seed explants in hot pepper（Capsicum annuum L.）[J]. Molecules and Cells，2001，12（2）： 221-226.

[7] 石 超，何秀霞，李彥舫. 三倍體毛白楊莖段遺傳轉化系統(tǒng)的建立[J]. 內蒙古民族大學學報，2003，18（3）： 232-234.

[8] 鄧 藝，曾炳山，趙思東，等. 乙酰丁香酮在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化中的作用機制及應用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（5）： 2229-2232.

[9] 寧 宇，苗永美，李 季，等. 黃瓜轉錄因子 CsCBF3的克隆及表達分析[J]. 中國蔬菜，2013（6）： 30-36.

[10] Stachel S E，Nerster E W，Zambryski P C. A plant cell factor induce Agrobacterium tumefaciens vir gene expression[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1986，83： 379-383.

[11] 陳丙春，齊一伯，唐 宇，等. 根癌農(nóng)桿菌介導的藍豬耳遺傳轉化[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報，2005，13（3）： 299-303.

[12] 席夢利. 衫木轉基因受體系統(tǒng)的建立及遺傳轉化研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學，2004.

[13] 楊秀榮，陳永文，方 平，等. 乙酰丁香酮對根癌農(nóng)桿菌介導的甘薯遺傳轉化的影響[J]. 西南師范大學學報，2002，27（5）： 751-754.

[14] 王躍華. 川黃柏高效遺傳轉化系統(tǒng)建立和植株再生研究[J]. 中藥材，2006，29（7）： 641-644.

[15] 郝彥玲，朱本忠，朱鴻亮，等. 根癌農(nóng)桿菌介導的向日葵遺傳轉化體系的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報，2005，13（6）： 713-717.

[16] 周 偉，姚倩雯，錢忠英，等. 丹參毛狀根誘導條件的優(yōu)化[J]. 上海師范大學學報，2007，36（2）： 93-98.

[17] Holford P，Hermandez N，Newbury H J. Factors influencing the efficiency of T-DNA transfer during co-cultivation of Antirrhinum majus with Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Cell Reports，1992，11（4）： 196-199.