高鵬 王學(xué)征 欒非時

在全基因組水平利用分子標記技術(shù)，構(gòu)建甜瓜種質(zhì)核酸指紋庫，建立早期、快速、準確的甜瓜種子純度、真實性及資源的遺傳血緣檢測技術(shù)。

1 關(guān)鍵技術(shù)核心

篩選出用于構(gòu)建甜瓜核酸指紋庫的核心引物是關(guān)鍵技術(shù)問題。利用20份具有代表性的甜瓜品種（系）篩選1219對SSR引物，得到多態(tài)性的引物470對。綜合考慮擴增條帶統(tǒng)計難易、多態(tài)性信息含量（PIC）、整合遺傳連鎖圖譜（ICUGI，2011，http：//www.icugi.org/.）等多種因素，最終選擇其中18對擴增多態(tài)性豐富的引物作為核心引物。經(jīng)過18對引物擴增后，可以對供試甜瓜品種（系）中的每一份材料建立了一個能區(qū)別于其他供試材料的指紋圖譜代碼。

2 技術(shù)流程

2.1 核心引物合成

按照表1合成18對核酸指紋庫核心引物。

2.2 待測樣品DNA提取

供試材料每份取10粒種子播種于8 cm×8 cm營養(yǎng)缽中，25 ℃、16 h/8 h光周期條件下生長，待同一品種植株生長到2葉1心時將每株幼嫩葉片摘下混勻，放入液氮中速凍，然后置于-80 ℃ 冰箱中保存。

DNA提取流程如下：

測定DNA原液濃度（分光光度計法），D260/OD280不足1.8或超過2.0的重新純化，將純化后的DNA稀釋到30 ng·μL備用。

2.3 PCR擴增

以樣品DNA作為模板，分別用18對核心引物對樣品DNA進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)條件見表3。

表2 PCR反應(yīng)體系

2.4 電泳

取PCR擴增樣品加入上樣緩沖液（98%甲酰胺，10 mM EDTA，0.25% 溴酚藍，0.25% 二甲苯青）6 μL混合，95 ℃ 變性5 min，4℃ 低溫保存。用6% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳，每個樣品取5 μl，恒功率70W電泳約90 min，終止電泳。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳各操作步驟如下：

（1）清洗玻璃板：洗滌劑清洗制膠玻璃板，然后用蒸餾水沖洗干凈并晾干。（2）擦板：將晾干的制膠玻璃板平放，先用蒸餾水擦拭玻璃板1次，然后用無水乙醇擦拭玻璃板1次，再用氯仿：剝離硅烷（49/1，V/V）擦拭短板，用親和硅烷（6 mL無水乙醇，12 μL冰醋酸，12 μL親和硅烷）擦拭長板。（3）灌膠：將長板與短板用夾子夾好，放平，取6% 聚丙烯酰胺膠60 mL，加入600 μL 10% 過硫酸銨和80 μL TEMED輕輕混勻，將板的灌膠邊微抬起，把膠緩緩灌入，待膠全部灌入板之間時，將梳子插入合適的位置，最后將制膠板調(diào)至水平，凝膠2 h后可用于電泳。（4）預(yù)電泳：小心拔出梳子，將玻璃板兩面沖洗干凈，擦干，放入電泳槽裝好，在電泳槽加入1×TBE，在80 W恒功率下預(yù)電泳20～30 min。（5）正式電泳：將點樣孔中雜質(zhì)用洗耳球吹出，然后加入5 μL已變性的擴增產(chǎn)物，70 W恒功率下電泳90 min。

2.5 銀染

（1）固定：電泳停止后將長板立即放入10%固定液（2 L蒸餾水，200 mL冰醋酸），在搖床上固定30 min。（2）漂洗：將固定好的長板用蒸餾水漂洗3次，每次2 min。（3）染色：將長板放入染色液（2 L蒸餾水，2.3 g AgNO3）中，染色10 min。（4）漂洗：在蒸餾水中漂洗2～3次（不超過10 s）。（5）顯影：將漂洗好的長板放入倒有預(yù)冷過的顯影液（2 L蒸餾水，32 g NaOH，用前3 min加入16 mL甲醛）中，定影10 min。（6）漂洗：將長板在蒸餾水中漂洗2～3次（不超過10 s）。（7）晾板：將漂洗后的長板撈出放好，室溫下自然風(fēng)干。（8）記錄：將晾干后的長板照相保存，統(tǒng)計結(jié)果。

2.6 指紋代碼記錄

每對SSR引物可以擴增出不同的多態(tài)性條帶，依據(jù)擴增條帶分子量從大到小的順序記錄各個條帶的分子量（單位為bp，在這里略去單位bp，只記錄數(shù)字），再將引物按照固定的順序進行編號，依次為A、B、C……，記錄每份材料經(jīng)不同的SSR引物擴增出現(xiàn)的條帶，如果一份材料經(jīng)同一引物擴增同時出現(xiàn)多條條帶，則用“-”連接數(shù)字，這樣每個品種的DNA經(jīng)不同的引物擴增后將會形成由字母和阿拉伯?dāng)?shù)字組成的一系列帶型編號，進一步形成了該品種的SSR指紋圖譜代碼。例如：如某品種的SSR指紋圖譜代碼為A100B300-200C0…Q300R250，則表示該品種經(jīng)A引物擴增出現(xiàn)了長度為“100 bp”條帶，經(jīng)B引物擴增出現(xiàn)了長度為“300 bp”和“200 bp”2條條帶，經(jīng)C引物沒有擴增出條帶……經(jīng)Q引物擴增出現(xiàn)了長度為“300 bp”的條帶，經(jīng)R引物擴增出現(xiàn)了長度為“250 bp”的條帶。

2.7 利用指紋代碼檢測種子

同物異名種子的判定：若獲得的指紋代碼與已知品種的指紋代碼完全一致則可初步判斷同物異名。同名異物種子的判定：若某品種的指紋代碼與其固有代碼不符則可判定同物異名。種子純度的檢測：選擇品種兩親本存在差異的一對SSR引物對雜交種進行PCR檢測，則F1種子均應(yīng)為雜合帶型，若其中出現(xiàn)單一帶型則說明種子不純。