武耀祥等

摘要：在長白山森林生態(tài)系統(tǒng)定位站，利用T-RFLP技術(shù)研究了6種不同森林類型土壤真菌組成及其分布特征。結(jié)果表明，6種不同森林類型土壤真菌多樣性指數(shù)以白樺林中后期最高，過熟闊葉紅松林次之，楊樺成熟林最低。不同森林類型的真菌群落相似度也很低，其數(shù)量、類型及分布均存在著差異。

關(guān)鍵詞：土壤；真菌；DNA提??；ITS-PCR；T-RFLP

中圖分類號：Q938.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1443-04

土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)中最重要的組分，在凋落物分解、腐殖質(zhì)合成以及養(yǎng)分循環(huán)等過程中起著十分重要的作用。其種類和組成不僅直接影響土壤的生物化學(xué)循環(huán)，而且是土壤生物活性的具體體現(xiàn)，并在森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中扮演著重要角色[1-3]。不同土壤分布著不同的土壤微生物，而不同的微生物多樣性又影響土壤功能的多樣性[4]。土壤微生物的組成和分布可以在深層次上揭示森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動。目前測定土壤微生物多樣性的方法主要有稀釋平板法、磷脂脂肪酸分析（PFLA）法、Biolog微平板分析法及分子生物學(xué)方法等[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在土壤微生物研究中的不斷發(fā)展，土壤微生物多樣性的研究有了新的突破。核糖體ITS區(qū)為非編碼區(qū)，受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度快。因此該區(qū)段能夠提供比較豐富的變異位點和信息位點，目前已經(jīng)用于種間、亞種和種群水平上的遺傳多樣性研究[6]。自從Innis等[7]1990年首先設(shè)計ITS引物對真菌核內(nèi)核糖體RNA基因進(jìn)行擴(kuò)增以來，ITS序列分析技術(shù)在真菌分類、鑒定的研究中應(yīng)用越來越廣泛。

該研究利用分子生物學(xué)技術(shù)對長白山自然保護(hù)區(qū)不同森林類型的土壤真菌群落組成進(jìn)行分析，比較不同植被類型與土壤真菌之間的關(guān)系及變化趨勢，以期加深對土壤真菌變化過程和機(jī)制的認(rèn)識，為長白山區(qū)域天然林保護(hù)和生態(tài)建設(shè)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品于2010年10月采自長白山自然保護(hù)區(qū)（表1）。按不同林型采用對角線型混合取樣法采集表層的土壤，采集深度為0～5 cm，用塑料袋封裝帶回。-80 ℃下密封保存。

1.2 試劑與儀器

Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ購自寶生物工程（大連）有限公司；土壤真菌基因組提取試劑盒購自MoBio Laboratories公司；DNA純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。Gene-9700型PCR擴(kuò)增儀、上海盧湘儀臺式離心機(jī)、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 方法

1.3.1 土壤樣品DNA的提取與檢測 土壤樣品DNA的提取參照MoBio土壤真菌提取試劑盒的方法。

1.3.2 ITS-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化 用于ITS片段擴(kuò)增的引物采用真菌ITS區(qū)通用引物ITS1-F和ITS4，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體序列如下：ITS1-F（5′→3′）：CTTGGTCATTTAGAGG

AAGTAA；ITS4（5′→3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。

ITS擴(kuò)增反應(yīng)體系為：5 μL 10×PCR Buffer（50 mmol/L KCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol/L MgCl2）、2 μL DNA模板、ITS1-F和ITS4（10 μmol/L）各2.5 μL、4 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像處理系統(tǒng)觀察拍照。

1.3.3 ITS-PCR產(chǎn)物的純化 采用DNA純化試劑盒，按照說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

1.3.4 ITS-PCR產(chǎn)物的限制性酶切分析 ITS-PCR產(chǎn)物的T-RFLP分析反應(yīng)體系為30 μL：含10 μL ITS-PCR產(chǎn)物、2 μL Hinf I（10 U/μL）、3 μL 10× Buffer、加ddH2O至30 μL。置于37 ℃水浴中酶切反應(yīng)4 h，然后65 ℃作用20 min終止反應(yīng)。將酶切產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司測序。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 每個T-RFLP的豐度百分比（Ap，%）按照公式Ap=ni/N×100%計算， 其中ni代表每個可分辨的T-RFLP的峰面積， N代表所有T-RFLP峰面積的總和。種群多樣性指數(shù)[8]用BIO-DAP軟件計算。依據(jù)公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）計算樣品之間Sorenson[9，10]的相似系數(shù)， 其中NA+B指兩樣品共有的條帶數(shù)目，NA、NB指兩樣品各自包含的條帶數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同森林類型土壤真菌T-RFLP分析結(jié)果

利用限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ對6種不同森林類型土壤真菌ITS區(qū)進(jìn)行酶切，T-RFLP分析結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，酶切譜帶清晰，RFLPs比較明顯，酶切片段在100～600 bp之間，不同森林類型真菌群落存在明顯差異。

2.2 不同森林類型土壤真菌多樣性

不同森林類型土壤真菌香農(nóng)多樣性指數(shù)、均勻度見表2。由表2可知，1號樣點的香農(nóng)多樣性指數(shù)最高，3號樣點的最低；1、2、3、5號樣點的均勻度高，4號樣點的均勻度最低。一般而言，多樣性越高群落穩(wěn)定性大，穩(wěn)定性的大小反映了多樣性的大小。植物根系可為微生物棲息提供很好的場所，植被覆蓋使得土壤濕度更適合于群落的發(fā)展，微生物群落的發(fā)展反過來又有利于植物群落的發(fā)展。

2.3 不同森林類型土壤真菌相似性

從不同森林類型土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相似性系數(shù)分析結(jié)果見表3。由于森林類型的不同，土壤的真菌群落也有較大差異，群落功能也有較大差異，甚至森林類型接近的土壤，真菌的相似性也比較低，森林土壤真菌的空間差異性很大。

3 小結(jié)與討論

3.1 土壤樣品DNA的提取與純化

如何獲得高質(zhì)量的土壤樣品總DNA是分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[11]，只有獲得高質(zhì)量的土壤樣品總DNA才能保證后續(xù)PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確、可靠。土樣中主要污染物為多糖、腐殖酸和酚類化合物，其中腐殖酸的理化性質(zhì)與核酸相似，因此在DNA提取過程中很難完全去除，而腐殖酸等雜質(zhì)會影響后續(xù)的PCR反應(yīng)[12]。

3.2 土壤真菌多樣性指數(shù)

香農(nóng)多樣性指數(shù)是一種評價不同土壤的微生物群落多樣性十分有效的方法，香農(nóng)多樣性指數(shù)越高表明微生物群落多樣性越大，它由種類的豐富度及種類的均勻度兩部分組成[13，14]。在不同類型的森林土壤中，真菌的群落香農(nóng)多樣性指數(shù)呈現(xiàn)出較大的差異性和復(fù)雜性，這可能是由于天然森林中的真菌的空間異質(zhì)性高所致。白樺林中后期和過熟闊葉紅松林，光照充足， 干擾少， 土壤結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定， 枯枝落葉積累多， 水分涵養(yǎng)好， 適合微生物生長， 所以土壤真菌的類群多，土壤相對較肥沃。從整體上來看， 白樺林中后期和闊葉紅松林土壤質(zhì)量高， 微生物種類多，土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有利于植物的生長。

該研究對不同森林類型土壤真菌群落的變化規(guī)律進(jìn)行研究， 探討了真菌群落的演替規(guī)律， 但對于真菌群落的變化規(guī)律以及微生物與植物之間如何互作還需進(jìn)一步研究。同時對于其他樣點的森林類型土壤微生物群落的變化規(guī)律如何還有待進(jìn)一步揭示。

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