范錚　李丹青　張國亮

摘要：以乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯作為溶劑對空心蓮子草全草有效成分進(jìn)行提取，采用抑菌圈法比較提取液對6種受試菌的抑菌作用，用稀釋法測定對受試菌的最小抑菌濃度。結(jié)果表明，空心蓮子草提取液有較強的抑菌活性，乙醇、石油醚提取液對黑曲霉的最小抑菌濃度為0.25%，乙醇提取液對口腔念珠菌的最小抑菌濃度為0.25%，乙醇提取液抑菌活性總體好于其他溶劑提取液，溶劑影響提取液的抑菌能力。不同溫度處理后乙醇提取液的抑菌活性測試表明提取液具有較好的熱穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：空心蓮子草；提取液；微生物；抑菌活性

中圖分類號：R151.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1317-03

空心蓮子草[Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb]又名螃蜞菊、空心莧、水花生、革命草，為挺水型水生植物，一般簇生或大面積形成墊狀物漂于水面，為外來物種。20世紀(jì)30年代傳入中國，能迅速在水體中滋生、繁衍，對環(huán)境要求低，現(xiàn)在分布范圍廣，資源極為豐富，可用作飼料、肥料，也用于污染水體的凈化和治理[1，2]?？招纳徸硬莺S酮甙、三萜皂甙、有機酸、酚類、香豆素、6-甲氧基木犀草素、7-α-L-鼠李糖甙及藤菊黃素等成分[3，4]。中醫(yī)認(rèn)為其性寒、味苦，有清熱、涼血、解毒的功能，可用于流行性乙型腦炎早期、流行性出血熱初期及血尿、尿路感染、麻疹的治療。試驗旨在探討空心蓮子草不同提取液對6種微生物的抑菌作用，希望能找出新的抗菌資源，為天然藥物的開發(fā)利用提供資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

空心蓮子草采自杭州市西湖茅家埠湖面，洗凈、自然曬干后粉碎，取200 g用150 mL乙醇恒溫60 ℃浸泡30 min過濾，濾渣重復(fù)提取3次，合并濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮成2 g的浸膏。同樣方法制得丙酮、乙酸乙酯、石油醚溶液浸膏。

1.2 供試菌種和培養(yǎng)基

大腸桿菌（Escherichia Coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium citrinum）由浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院微生物教研室提供；變形鏈球菌（Streptococcus mutans）、口腔念珠菌（Oral candidosis）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院化驗室提供。蛋白胨營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（用于細(xì)菌培養(yǎng)）配方為牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、 瓊脂18 g、水1 L，pH 7.2～7.6；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（用于真菌培養(yǎng)）配方為馬鈴薯20 g、葡萄糖2 g、瓊脂2 g、水1 L。

1.3 試劑及儀器

主要試劑有乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯，為市售分析純；主要儀器有XM-52型高壓蒸氣滅菌鍋、Yamato RE540型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、LRH-250A型生物培養(yǎng)箱、DGG-9053A型恒溫干燥箱、48Q SG4A 280型滅菌箱、SW-CJ-IF型無菌操作臺、FA-2004型電子天平。

2 試驗方法

2.1 菌懸液的制備

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌37 ℃培養(yǎng)24 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，配制成107 CFU/mL的菌懸液。黑曲霉、青霉、口腔念珠菌28 ℃培養(yǎng)48 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，配制成107 CFU/mL的菌懸液[5，6]。

2.2 抑菌活性的測定

采用濾紙片法測定抑菌作用。在培養(yǎng)基表面接種50 μL菌懸液并涂布均勻。取各浸膏配制成30 mg/mL提取物溶液（提取液），取已滅菌直徑6 mm干燥濾紙片浸于提取物溶液，濾紙片自然干燥10 min后貼于平板表面，每皿內(nèi)貼4片，以相應(yīng)的溶劑為空白對照。各皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌37 ℃培養(yǎng)24 h，黑曲霉、青霉、口腔念珠菌28 ℃培養(yǎng)48 h，3次重復(fù)。十字交叉法測定抑菌圈直徑，取平均值[7-9]。

2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定

取各浸膏分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)（濃度）為4.00%、2.00%、1.00%、0.50%、0.25%的提取物平板，吸取0.1 mL的菌懸液加入到平板，用無菌棉簽涂布均勻，置于恒溫箱中（細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃培養(yǎng)48 h）培養(yǎng)后檢測，以無菌斑產(chǎn)生的最小提取物濃度為最小抑菌濃度（MIC）[10，11]。

2.4 提取液抑菌活性的熱穩(wěn)定性測定

選用空心蓮子草的乙醇提取物，用無菌水配成10 mg/mL溶液，無菌封裝后分別置于20、40、60、80、100 ℃水浴和120 ℃濕熱條件下處理15 min，按2.2方法測定其抑菌活性[11]。

3 結(jié)果與分析

3.1 空心蓮子草提取液對供試菌的抑菌作用

由空心蓮子草提取液對各供試菌的抑菌試驗結(jié)果（表1）可知，幾種有機溶劑提取液都有較好的抑菌作用，說明提取液中有抑菌的成分。對不同菌的抑制作用有差異，對黑曲霉抑菌作用表現(xiàn)較好，對金黃色葡萄球菌抑菌作用表現(xiàn)較差，說明不同溶劑的提取液抑菌效果不同，各提取液的抑菌成分存在一定的差異。溶劑影響空心蓮子草的抑菌物質(zhì)提取，也影響提取液的抑菌能力。

3.2 空心蓮子草提取液對供試菌的MIC

由空心蓮子草提取液對供試菌的MIC測定結(jié)果（表2）可以看出，提取液濃度為4.00%時6種供試菌生長完全受到抑制，培養(yǎng)皿中無菌斑生長；隨著提取液濃度的降低，抑菌能力下降，不同提取液對不同供試菌的作用有所差別。當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇提取液濃度為0.50%時，6種供試菌的生長完全受到抑制，為0.25%時黑曲霉和口腔念珠菌生長完全受到抑制；當(dāng)培養(yǎng)基中石油醚提取液濃度為1.00%時，6種供試菌的生長完全受到抑制，為0.25%時黑曲霉的生長完全受到抑制；當(dāng)培養(yǎng)基中丙酮提取液濃度為2.00%時，6種供試菌的生長完全受到抑制，為0.50%時口腔念珠菌的生長完全受到抑制；當(dāng)培養(yǎng)基中乙酸乙酯提取液濃度為2.00%時，6種供試菌的生長完全受到抑制，為0.50%時變形鏈球菌的生長完全受到抑制。乙醇、石油醚提取液對黑曲霉的最小抑菌濃度為0.25%，乙醇提取液對口腔念珠菌的最小抑菌濃度為0.25%。

從上述結(jié)果可知，乙醇提取液抑菌效果最好；丙酮提取液也有較強的抑菌作用。4種提取液對黑曲霉、口腔念珠菌抑菌作用較明顯。

3.3 空心蓮子草乙醇提取液抑菌活性的熱穩(wěn)定性

測定不同溫度對乙醇提取液抑菌活性的影響（圖1）可知，空心蓮子草乙醇提取液經(jīng)不同溫度處理后，基本保持了原有的抑菌活性，表明提取液的抑菌活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

4 小結(jié)與討論

空心蓮子草提取液具有較強的抑菌作用。4種溶劑提取液對6種供試菌均有較強的抑菌作用，說明4種溶劑均能提取空心蓮子草中有效抑菌成分，其中乙醇提取液的抑菌效果較好，幾種提取液對黑曲霉、口腔念珠菌的抑菌作用較強?？梢娍招纳徸硬菟煞謱Σ糠治⑸镉忻黠@的抑制作用，具體作用成分有待進(jìn)一步分析確認(rèn)。

當(dāng)前新的致病菌不斷出現(xiàn)，而微生物的抗藥性不斷增強，開發(fā)研制新型抗菌藥已顯得越來越重要。中國植物資源極為豐富，從中提取有效抑菌成分，用以抑制、治療病菌感染有較好的應(yīng)用前景。對于入侵植物空心蓮子草，如能作為藥品的原料，則可變廢為寶、化害為利。

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