孫海偉 曹德航 尚濤等

作者簡介：孫海偉（1973-），男，博士，副研究員，主要從事茶樹、果樹遺傳育種研究。

摘要：茶樹[Camellia sinensis（L）OKuntze]是原產我國的葉用木本植物，山東自“南茶北引”取得成功以來，冬季低溫脅迫導致的凍害常造成經濟損失。所以，抗寒育種研究一直是茶樹研究的熱點和難點。本文闡述了茶樹抗寒育種的研究進展，包括抗寒性研究、選育的抗寒品種、抗寒基因的分離和鑒定及轉基因研究現狀。

關鍵詞：茶樹；抗寒育種；抗寒基因；轉基因

中圖分類號：S571.103.4 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）06-0119-05

茶樹[Camellia sinensis（L）OKuntze]屬山茶科，山茶屬，原產于我國西南地區(qū)，是一種喜溫暖氣候條件的葉用植物。隨著人們對茶葉保健功能的認識，茶葉需求量逐年增加，茶樹栽培面積不斷擴大，種植區(qū)域不斷向北方拓展。山東省是我國的次適宜高緯度茶區(qū)，由于冬季氣溫低、持續(xù)時間長，茶樹極易受到凍害影響，給茶葉生產帶來嚴重的損失。自20世紀50年代末嘗試引種茶樹以來，山東茶樹引種栽培面積已經達到167×104 hm2[1]，幾乎每年都要遭受不同程度的低溫凍害，導致嚴重的經濟損失。因此，抗寒育種成為茶樹育種研究的熱點。

1 茶樹抗寒性的研究

茶樹的抗寒性是在茶樹長期適應低溫脅迫的過程中通過自然選擇而逐步發(fā)展和形成的一種形態(tài)和生理特征。茶樹等溫帶地區(qū)的常綠闊葉樹種在抗寒機理上與草本植物和落葉木本植物有所不同：與草本植物相比，其冷馴化能力大得多，冷馴化機制更為復雜；與落葉木本植物相比，盡管具有季節(jié)性生長調節(jié)的特性，但其越冬葉卻沒有落葉木本植物葉那種遇冷引發(fā)的衰老、脫落過程，也不存在類似芽的內生性休眠過渡。研究者們先后從葉片的形態(tài)及解剖結構變化、束縛水含量、細胞液濃度、保護酶類（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等酶類）、低溫膜損傷、茶樹冰核活性細菌等多方面探索了茶樹的抗寒機理[2～11]，也找到了相應的技術措施來提高茶樹抗寒能力，但是幾乎所有措施都需要投入大量的人力、物力、財力[1]。選育抗凍能力突出的良種，改良茶樹自身的遺傳因素來提高抗寒性能以抵御低溫脅迫是解決這一問題最根本的方法[12]。

何孝延[2]對30份烏龍茶品種資源進行抗寒性鑒定，結果表明，從整體而言，福建烏龍茶品種間的抗寒性無明顯差異，均表現為較抗寒類型。梅麗等[3]以從山東省茶葉主要產區(qū)（泰安市、青島市、日照市）采集的共計51個茶樹類型和品種的葉片為材料，對其內部結構與抗寒性的關系、內部結構與生產力指數的關系和束縛水含量進行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現山東引種茶樹由于樣品間的差異以及所處地區(qū)的不同，抗寒能力與生產力指數均表現出明顯的差異；在所用的樣品中，抗寒能力勁峰最強，生產力指數福鼎大白毫最高，束縛水含量類型3最高、云南小葉最低；相關性分析表明，對山東引種茶樹進行抗寒性評價時除了依據柵欄組織/海綿組織之外，柵欄組織細胞數目也是一個重要的評價指標；束縛水的含量與基于葉片解剖結構計算的抗寒性指標之間未見明顯的相關性，而束縛水含量/自由水含量與基于葉片解剖結構計算的抗寒性指標之間可見一定程度的正相關；進行生產力評價時除了依據柵欄組織厚度與柵欄組織細胞數目之外，葉肉組織厚度與葉全厚度也是比較可靠的評價指標，基于葉片解剖結構計算的抗寒性指標與生產力指數之間呈不顯著的正相關。孫銳等[4]選取山東引種茶樹的抗寒性較強的勁峰和抗寒性較弱的黃早作為材料，在冰凍脅迫條件下觀察細胞、組織水平的結構變化，評價凍害的影響和受凍的原因，并且探討了細胞內各種細胞器對凍害表現出的不同穩(wěn)定性。孫仲序等[5]經對山東10地市茶區(qū)、6個氣象因子作最短距離聚類分析得出，山東茶主要分布在4個生態(tài)類型區(qū)域內，茶樹凍害由輕到重呈花斑式分布；各氣象因子與葉片組織結構變化呈正相關性，以年降水量和極端最低溫度對茶樹變異影響最大，其次是年平均溫度、無霜期和日照時數，1月份年均氣溫對葉片結構變化影響不大；葉片結構以柵欄組織厚度對氣候條件最敏感，其次是柵欄組織與海綿組織的比值、海綿組織厚度，葉片厚度和上表皮厚度與氣象因子無關。楊亞軍等[7]研究了冷馴化和ABA對茶樹抗寒力及其體內脯氨酸含量的影響，結果表明，通過冷馴化或者ABA處理，茶樹經歷了馴化再到脫馴化的過程，其抗寒力也相應地發(fā)生了很大的變化，由馴化前的幾乎為零逐漸提高，而隨著脫馴化的進行又迅速恢復到馴化前的水平；低溫馴化的臨界溫度為7℃左右，脫馴化的臨界溫度為9℃左右；人工低溫馴化和ABA處理，茶樹抗寒力的提高幅度沒有自然冷馴化下的大；冷馴化中茶樹體內脯氨酸含量變化是對外界條件變化的一種綜合反應，很難說明單一的脯氨酸含量與抗寒力之間的因果關系。楊華等[13]采用以生物膜學說為依據的電導法，經過不同低溫脅迫處理對川茶群體種、平陽特早、烏牛早、云南大葉種等4個茶樹品種的新梢（一芽三葉）和成熟葉片組織進行了抗寒性測定，并結合Logistic方程分別計算了各茶樹品種的低溫半致死溫度（LT50），列出了供試品種抗寒性的相對強弱順序為：平陽特早>烏牛早>川茶群體種>云南大葉種。

2 茶樹抗寒育種研究

多年來，茶樹育種研究工作者不斷選育出抗寒性茶樹品種（系）。如前蘇聯研究人員用中國種和印度種的雜交種混合花粉進行輔助授粉，培育的格魯吉亞系7、8、12號，可以在-20℃的嚴寒地區(qū)栽培過冬。日本用茶和茶梅進行種間雜交所獲得的茶梅系，其抗凍性大大提高[1]。近年來我國也相繼獲得了一些抗寒性強的優(yōu)良品種，安徽農業(yè)大學茶學系選育出特早生特抗寒茶樹新品種“農抗早”和早生抗寒優(yōu)質茶樹新品系“茶農1號”[14，15]。浙江大學茶葉研究所選育出早生優(yōu)質抗寒茶樹新品種“浙農117” [16]。泰安市泰山林業(yè)科學研究院選育出“羅漢1號”[17]。由于茶樹為多年生木本植物，選育一個良種周期較長，且大部分品種的抗寒能力并沒有得到顯著改善，在生產中仍然會發(fā)生凍害。因此，利用輻射誘變、轉基因等各種育種方法將抗性基因轉移入農藝性狀優(yōu)良的品種（系）中去，培育出優(yōu)質高抗的新品種（系），會大大縮短常規(guī)育種的周期，獲得事半功倍的效果[6]。進行茶樹抗性的轉基因育種，是茶樹抗性突破性育種的一個重要手段。下一步，應加大對茶樹重要相關功能基因的研究投入，摸清主要性狀的遺傳規(guī)律和相關基因的調控機制，為茶樹的定向育種和分子育種奠定理論基礎。3 茶樹抗寒基因的分離和鑒定

近幾年，隨著擬南芥等模式植物抗寒機理系統(tǒng)研究的深入，茶樹抗寒分子機制研究出現熱潮。陳喧等[18]發(fā)現茶樹CBF基因只有低溫誘導后才會表達，低溫誘導4 h開始表達，在8 h左右表達量最高，然后開始下降，但仍維持在一個較高的水平。在植物抗寒途徑中，COR作為一種重要的冷應答蛋白，被CBF激活后，激活一系列下游基因表達，抵抗低溫。梅菊芬等[19]采用mRNA差別顯示的方法對茶樹冷馴化過程中基因差異表達進行了初步研究，從58條差異片段中得到穩(wěn)定擴增的差異片段23條，用RT-PCR方法鑒定其假陽性，得到5個陽性片段，其中3個片段在冷馴化過程中表達量增加，另外2個片段的表達量降低。陳林波等[20]以中小葉茶樹良種舒茶早和云南大葉種73-11為材料，于4℃低溫處理4 d后，采用AFLP技術篩選出冷誘導下茶樹差異表達基因并進行分析，結果獲得41個差異片段（TDFs），按功能可劃分為4類，即信號傳導蛋白、轉錄因子、基礎代謝相關蛋白、抗逆蛋白質，此外還有一些假設蛋白質及未知蛋白；利用qRT-PCR方法對Kh1、Kh3和Kh11差異片段進行驗證，結果顯示這3個片段均被低溫誘導，表達量上升。房婉萍等[21]利用cDNA-AFLP的方法分離克隆了茶樹中的H1-histone基因，BLAST比對結果顯示，該片段與其它物種逆境誘導特異表達的H1-histone基因有很高的相似性，與煙草H1-histone基因編碼的氨基酸序列一致性達79%。冷脅迫條件下，茶樹的H1-histone在代謝中轉化為H1-S，H1-S的聚集會改變染色質的結構，對逆境信號進行響應，調控下游的一系列蛋白或響應因子做不同形式的表達，與冷脅迫直接相關的基因CBF、COR、ICE的啟動與調控都可能與H1-histone基因的調控相關。張莉等[22]利用cDNA-AFLP分析在-70℃貯藏1年后的茶籽基因表達，篩選到10個低溫差異表達片段，其中有7個與MYB類轉錄因子等有較高同源性。李先文等[23]運用RACE技術從茶葉中克隆出一個冷誘導基因CsCOR1的全長cDNA序列，并通過Real-time RT PCR方法分析了該基因在低溫、高滲和外源ABA處理時的表達狀況，結果顯示CsCOR1基因的表達可被低溫和脫水脅迫劇烈上調，可被外源ABA中度上調。鄒中偉等[24]利用cDNA-AFLP技術獲得了茶樹低溫表達的86個差異片段，在選擇回收的10條差異表達cDNA片段中，有4個片段與低溫脅迫有關。4 茶樹轉基因的研究

自20世紀90年代開展茶樹再生體系及基因遺傳轉化研究以來，一直未有很大的進展，大量的工作都停留在轉化體系優(yōu)化的階段。在研究人員的積極探索下，雖然有少量通過轉化體胚得到轉基因植株的報道，但茶樹體胚的誘導體系仍未建立[25～31]。目前只有Bt基因、蛋白溶解酶基因嘗試向茶樹中轉化，但由于茶樹離體再生困難，受過創(chuàng)傷的茶樹受體轉化后的再生效率低，最終轉基因成功的報道僅1例[32]，而且還是通過嫁接轉基因嫩梢獲得的轉基因植株。

茶樹轉基因技術存在的主要問題有：一是轉化效率低。茶樹中富含多酚類物質，多酚類物質一方面作為一種抑菌劑，直接殺死農桿菌而影響轉化率；另一方面作為蛋白質的沉淀劑，阻塞發(fā)根農桿菌的T-DNA向茶樹細胞運轉的通道，從而間接影響茶樹的遺傳轉化。迄今國內外農桿菌介導茶樹進行遺傳轉化成功率低的主要原因是缺乏穩(wěn)定完善的農桿菌介導的茶樹遺傳轉化培養(yǎng)體系。二是茶樹離體再生困難。高效的遺傳轉化體系依賴于高頻的再生體系。茶樹的離體再生難度大，特別是器官發(fā)生途徑的植株再生。除子葉容易產生體細胞胚外，茶樹的各種器官都不容易再生，茶樹的莖段有再生成功的報道，但芽再生頻率很低，尚不明確哪種組織的再生能力強[33～36]。這些可能是導致部分遺傳轉化失敗的主要原因?，F代植物育種技術發(fā)展迅速，轉基因等新的育種手段已經在其他植物上取得成功。今后，茶樹育種應借鑒其它植物成功的經驗，加強技術攻關，在茶樹穩(wěn)定遺傳轉化體系的建立、轉基因育種等方面做好技術儲備。

5 展望

來自熱帶和亞熱帶的許多作物缺乏冷馴化的能力，無法在溫帶以北的地區(qū)露地安全越冬，只有完成低溫馴化才可能忍耐較低的溫度而不受傷害。在馴化過程中涉及大量的基因表達重組和代謝變化，經典遺傳學研究表明植物冷馴化能力是由微效多基因共同控制的數量性狀[37]。傳統(tǒng)的育種方法在改善植物耐凍性方面取得的成效非常有限，對提高植物抗寒性的作用不大[38]，例如到目前為止小麥品種和油菜品種抗寒性，只比幾百年前的品種稍微有點改善[39，40]。

茶樹起源于亞熱帶，多年生木本植物，由于生長周期長，采用常規(guī)抗寒育種技術進行新品種選育所需時間長、見效慢，同時還存在基因源缺乏、雜合程度高和雜交不親和等制約因素。所以，通過確定茶樹抗凍基因的性質，了解其感受低溫和調控抗凍性表達機制，利用現代生物學技術改進其遺傳組成，進行抗凍性分子改良，具有高效性和針對性，可彌補常規(guī)育種技術的不足，加速高抗凍性茶樹新品種的選育進程。

當前我國茶樹抗寒性和抗寒育種研究雖然取得了一定的進展，但在抗寒分子機制、轉基因研究等方面還缺乏深入研究，下一步還需要遺傳學、育種學、生理學、植物保護學、分子生物學等多學科長期不懈的協作，開創(chuàng)茶樹抗寒分子育種研究的新局面。

參 考 文 獻：

[1] 房 用，李秀芬，慕宗昭，等茶樹抗寒性研究進展[J]經濟林研究，2004，22（2）：69-72

[2] 何孝延福建烏龍茶品種資源抗寒性鑒定與評價[J]中國種業(yè)，2004，5：29-30

[3] 梅 麗山東引種茶樹葉片結構與抗寒性評價研究[D]濟南：山東大學，2003

[4] 孫 銳，魯 南山東引種茶樹抗寒性研究[J]山東輕工業(yè)學院學報，2006，20（1）：82-85，93

[5] 孫仲序，劉 靜，邱治霖山東省茶樹抗寒變異特性的研究[J]茶葉科學，2003，23（1）：61-65

[6] 王新超，楊亞軍茶樹抗性育種研究現狀[J]茶葉科學，2003，23（2）：94-98

[7] 楊亞軍，鄭雷英，王新超冷馴化和ABA對茶樹抗寒力及其體內脯氨酸含量的影響[J]茶葉科學，2004，24 （3）：177-182

[8] 王 玉，王 會，丁兆堂 茶樹黃山種自然雜交后代抗寒性研究[J]山東農業(yè)科學，2012，44（5）：28-32

[9] 黃曉琴，束懷瑞，劉會香，等山東省茶樹冰核細菌的鑒定[J] 茶葉科學，2010，30（3）：191-194

[10] 張翠玲，胡維軍，侯君合，等嶗山茶區(qū)8個耐寒茶樹單株篩選研究[J] 山東農業(yè)科學，2007，39（4）：56-58

[11] 時 慧， 王 玉， 周克福 低溫脅迫下茶樹葉片活性氧代謝及滲透調節(jié)物質含量的變化規(guī)律[J] 山東農業(yè)科學，2012，44（7）：22-25

[12] 王 玉，范 凱，丁兆堂茶樹抗寒基因連鎖的ISSR標記及其SCAR標記的初步建立[J]基因組學與應用生物學，2011，30：1238-1243

[13] 楊 華，唐 茜，黃 毅用電導法配合Logistic方程鑒定茶樹的抗寒性[J]福建茶葉，2006，3：30-32

[14] 王朝霞，江昌俊，李 娟早生抗寒優(yōu)質茶樹新品系“茶農1號”的選育[J]園藝園林科學，2006，22（4）：324-327

[15] 楊維時，胡紹德特早生特抗寒茶樹新品種“農抗早”選育初報[J]福建茶葉，2000， 4：12-13

[16] 劉祖生，梁月榮，趙 東早生優(yōu)質抗寒茶樹新品種“浙農117”選育研究[J]茶葉，2000，26（1）：14-18

[17] 劉 靜，孫海偉，張 虹，等山東抗寒茶樹良種—“羅漢1號”茶選育研究[J]山東農業(yè)大學學報（自然科學版），2007，38（4）：566-573

[18] 陳 喧，房婉萍，鄒中偉，等茶樹冷脅迫誘導抗寒基因CBF的克隆與表達分析[J]茶葉科學，2009，29（1）：53-59

[19] 梅菊芬，湯茶琴，徐德良，等利用DDRT-PCR分析茶樹冬季冷馴化過程中基因表達的差異[J]熱帶作物學報，2011，4：648-652

[20] 陳林波，李葉云，房 超，等茶樹冷誘導基因的AFLP篩選及其表達分析[J] 西北植物學報，2011，31（1）：1-7

[21] 房婉萍，鄒中偉，侯喜林，等茶樹冷脅迫誘導H1-histone基因的克隆與序列分析[J]西北植物學報，2009，29（8）：1514-1519

[22] 張 莉，江昌俊，胥振國，等用cDNA-AFLP技術研究茶樹種子在低溫貯藏過程中差異基因的表達[J]安徽農業(yè)大學學報，2008，35（3）：319-323

[23] 李先文，余海波，孟 瓊，等茶樹一個冷誘導基因的克隆及其表達分析[J]中國農學通報，2011，27（19）：100-104

[24] 鄒中偉，房婉萍，張 定，等低溫脅迫下茶樹基因表達的差異分析[J]茶葉科學，2008，28（4）：249-254

[25] 吳 姍，梁月榮，陸建良，等茶樹農桿菌轉化系統(tǒng)和基因槍轉化系統(tǒng)的優(yōu)化[J]茶葉科學，2003，13（1）：6-10

[26] 吳 姍，梁月榮，陸建良，等基因槍及其與農桿菌相結合的茶樹外源基因轉化條件優(yōu)化[J]茶葉科學，2005，25（4）：255-264

[27] 奚 彪，劉組生，梁月榮，等發(fā)根農桿菌介導的茶樹遺傳轉化[J]茶葉科學，1997，增刊：155-156

[28] 奚 彪茶樹再生系統(tǒng)建立與遺傳轉化的研究[D]杭州：浙江農業(yè)大學，1995

[29] 項 威，賀志榮，魏 書根癌農桿菌介導茶樹轉基因體系的建立[J]安徽農業(yè)大學學報，2012，39（5）：721-724

[30] 彭正云，劉德華，肖海軍，等發(fā)根農桿菌轉化茶樹的研究[J]湖南農業(yè)大學學報（自然科學版），2006，32（2）：190-194

[31] 趙 東茶樹多酚氧化酶基因的克隆和轉化系統(tǒng)的研究[D]杭州：浙江農業(yè)大學，2001

[32] Mondal T K，Bhattacharya A，Ahuja P S Transgenic tea [Camellia sinensis （L） O Kuntze cv Kangra Jat] plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos[J] Plant Cell Reports，2001，20：712-720

[33] 譚和平，周李華，錢杉杉，等茶樹轉基因技術研究進展[J]武漢植物學研究，2009，27（3）：323-326

[34] 鄧江明，簡令成植物抗凍機理研究新進展：抗凍基因表達及其功能[J]植物學通報，2001， 18（5）：521-530

[35] 陳香波，張愛平，姚泉洪植物抗寒基因工程研究進展[J] 生物技術通訊，2001，12（4）：318-323

[36] 王憑青，吳明生，王遠亮，等植物抗寒基因工程研究最新進展[J]重慶大學學報，2003，26（7）：81-85

[37] Thomashow M FRole of cold-responsive genes in plant freezing tolerance[J] Plant Physiol，1998，118（1）：1-8

[38] Sarhan F， Danyluk J Engineering cold-tolerant crops-throwing the master switch[J] Trends in Plant Science，1998，3（8）：289-290

[39] Fowler D B， Gusta L V Selection for winter hardiness in wheat I Identification of genotypic variability[J] Crop Science，1979，19（6）：769-772

[40] Rapacz M， Markowski A Winter hardiness，frost resistance and vernalization requirement of European winter oilseed rape（Brassica napus var oleifera）cultivars within the last 20 years[J] Journal of Agronomy and Crop Science，1999，183（4）：243-253