萬(wàn)珊 朱曦 梁利妹 董文婷

摘要：黃曲霉毒素M1（ AFM1）是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素B1（AFB1）后在體內(nèi)經(jīng)羥基化形成的代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的毒性，存在于乳中。介紹了黃曲霉毒素M1（ AFM1） 的危害以及牛奶中黃曲霉毒素M1的薄層色譜（TLC）檢測(cè)法、高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)法和快速檢測(cè)法，并比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素 M1；危害；檢測(cè)方法；比較

中圖分類(lèi)號(hào)：TS252.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2013）06-0078-03

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的代謝產(chǎn)物，之所以廣受重視是因?yàn)樗侨祟?lèi)癌癥的一個(gè)重要的致癌源。至今已分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，在天然食物中以黃曲霉毒素B1最為多見(jiàn)。在AF中，已知毒性大小順序?yàn)锳FB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFG。

黃曲霉毒素 M1（Aflatoxin M1，AFM1）是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在體內(nèi)經(jīng)羥基化形成的代謝產(chǎn)物，毒性?xún)H次于AFB1，WHO將其列為ⅡB類(lèi)致癌物。AFM1主要存在于動(dòng)物的乳、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿中，其中以乳中最為常見(jiàn)。

把發(fā)霉的谷物作為飼料，其中的黃曲霉毒素在24 h之后就能進(jìn)入奶中。王蕾指出黃曲霉毒素被動(dòng)物食用后，一部分會(huì)蓄積在動(dòng)物的體內(nèi)，另外一部分則會(huì)轉(zhuǎn)化到乳汁和尿液中，轉(zhuǎn)化率一般為3.45%～11.39%[1]，排出AFM1的量為AFB1攝入量的1%～3%[2]。

1 黃曲霉毒素M1的基本性質(zhì)及危害

黃曲霉毒素基本結(jié)構(gòu)由一個(gè)二呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)M成，前者為其毒性結(jié)構(gòu)，后者可能與其致癌作用有關(guān)。黃曲霉毒素M1一旦產(chǎn)生便很難消除，因?yàn)樗鼘?duì)光、熱和酸都比較穩(wěn)定，熔點(diǎn)（裂解溫度）在299 ℃。牛奶常見(jiàn)的3種消毒方法都對(duì)它無(wú)可奈何。

黃曲霉毒素M1進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)后，除抑制DNA、RNA合成外， 也抑制肝臟蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致人體中毒。其危害主要表現(xiàn)在3個(gè)方面：損害組織器官；致癌、致畸、致突變，引發(fā)動(dòng)物及人類(lèi)的肝癌、腎癌和胃癌等[3-5]；抑制免疫機(jī)能。其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，主要危害的部位在肝臟。

2 牛奶中AFM1的限量

牛奶中AFM1限量取決于科學(xué)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)方面的諸多因素，這些因素相互影響、制約，綜合地決定牛奶中AFM1限量值。目前，世界各國(guó)對(duì)食品中AFM1的含量都制定出了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。牛奶中AFM1限量值采用0.05 μg/kg的國(guó)家最多，為34個(gè)，其中絕大部分國(guó)家是歐盟成員國(guó)以及與歐盟有貿(mào)易的非洲、亞洲、拉丁美洲部分國(guó)家，歐盟對(duì)嬰幼兒配方食品，包括嬰幼兒配方牛奶限量0.025 μg/kg。另一個(gè)限量值為0.5 μg/kg，有22個(gè)國(guó)家，包括美國(guó)、中國(guó)以及若干亞洲和歐洲國(guó)家。還有4個(gè)國(guó)家分別采用15、5、0.2 μg/kg以及不得檢出[6]。一些主要國(guó)家牛奶中AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

3 牛奶中AFM1的檢測(cè)方法

3.1 薄層層析法（TLC法）

TLC法是測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素的經(jīng)典方法，是通過(guò)肉眼比較定性或者半定量的檢測(cè)方法。其原理是將樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，AFM1在紫外光（波長(zhǎng)365 nm）下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量與標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度相比較來(lái)測(cè)定含量。GB 5009.24～2010食品中黃曲霉毒素M1和B1的測(cè)定、ISO 14674：2005（IDF 190：2005）牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1的測(cè)定、AOAC 974.17乳制品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定和AOAC 980.21牛奶和奶酪黃曲霉毒素M1的測(cè)定就是采用的TLC法[7-10]。

TLC法的優(yōu)點(diǎn)在于不依賴(lài)特殊儀器，成本低，易于普及，雙向展開(kāi)避免了雜質(zhì)干擾，被用于大規(guī)模的篩查研究中。雖然TLC法是牛奶中黃曲霉毒素M1 測(cè)定的官方規(guī)定方法之一，但是隨著高效液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)的發(fā)展，TLC的缺點(diǎn)也逐漸顯現(xiàn)：對(duì)樣品處理繁瑣，過(guò)程復(fù)雜，且提取和凈化效果不夠理想，雙向展開(kāi)增加了操作步驟和時(shí)間，對(duì)人和環(huán)境污染系數(shù)較大。

3.2 高效液相色譜法（HPLC法）

HPLC法是利用免疫親和柱或C18柱將樣品中的AFM1萃取、凈化、濃縮、分離，再通過(guò)HPLC串聯(lián)不同檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。免疫親和柱是利用抗原抗體的特異性吸附特性， 親和柱只能特異性、選擇性地吸附AF，而其他雜質(zhì)則順利通過(guò)柱子， 然后再利用洗脫液將AF洗脫下來(lái)。該方法大大簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程， 同時(shí)利用高效液相色譜進(jìn)行定量和定性， 可以同時(shí)測(cè)出AF的總量和AFM1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2各自含量。我國(guó)GB/T 23212～2008牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2的測(cè)定和GB 5413.37～2010乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定（第一法免疫親和層析凈化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法）均是采用免疫親和柱萃取分離AFM1[11，12]。熒光（Fluorescence detection， FLD）、質(zhì) 譜（Mass spectrometry， MS）等的定量測(cè)定被廣泛用于牛奶中AFM1的檢測(cè)。

3.2.1 HPLC-FLD 配以熒光檢測(cè)器的反相HPLC法已經(jīng)成為檢測(cè)黃曲霉毒素的主要測(cè)定方法，這是因?yàn)榉聪郒PLC方法具有同時(shí)分離多種黃曲霉毒素的功能和快速、高效、靈敏、定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，而且不受樣品的沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性和分子量等的限制；熒光檢測(cè)器具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分離能力強(qiáng)、干擾峰少的優(yōu)點(diǎn)，而牛奶中AFM1具有較強(qiáng)的發(fā)射熒光特性。

3.2.2 HPLC-MS 質(zhì)譜法是通過(guò)將試樣分子裂解為分子離子和各種離子碎片的集合，按質(zhì)荷比（m/z）大小進(jìn)行分離、記錄的分析方法。MS檢測(cè)器具有更高的選擇性、對(duì)分析物分子標(biāo)識(shí)的確證、可用同位素標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo)等優(yōu)勢(shì)，HPLC-MS比傳統(tǒng)液相檢測(cè)器靈敏度更高，選擇性更強(qiáng)，提供了可靠、精確的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，節(jié)省了樣品準(zhǔn)備時(shí)間和分析時(shí)間，廣泛應(yīng)用于AFM1的檢測(cè)中。ISO 14501：2007（IDF 171：2007）牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1含量的測(cè)定和我國(guó)GB 5413.37-2010乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定（第一法免疫親和層析凈化 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）采用的就是LC-MS法檢測(cè)奶中的黃曲霉毒素M1[12]。

3.3 免疫層析凈化熒光分光度法

免疫層析凈化熒光分光度法的原理是將試樣經(jīng)過(guò)離心、脫脂、過(guò)濾后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素M1特異性單克隆抗體的免疫親和柱層析凈化，除去其他雜質(zhì)， 再洗脫下黃曲霉毒素M1，用熒光光度計(jì)測(cè)定黃曲霉毒素M1的含量。其中測(cè)定時(shí)是先用熒光光度計(jì)標(biāo)定溶液進(jìn)行熒光光度計(jì)校準(zhǔn)，再進(jìn)行AFM1的含量的測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)在于分析過(guò)程中不使用AFM1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，避免了操作人員造成的污染危險(xiǎn)，不用擔(dān)心AFM1標(biāo)準(zhǔn)品的購(gòu)買(mǎi)困難，具有準(zhǔn)確、快速、安全、簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可以滿足少量和批量樣品的檢測(cè)需要[13]。我國(guó)GB 5413.37-2010乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定（第三法免疫層析凈化熒光分光度法）采用的就是此種方法檢測(cè)奶中的黃曲霉毒素M1[12]。

3.4 快速檢測(cè)法

3.4.1酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在黃曲霉毒素分析過(guò)程中是最為引人注目的，因?yàn)樗鼈兙哂懈叨鹊撵`敏度和選擇性，而且具有快速和大批量檢測(cè)的能力。ELISA的原理是樣品中的黃曲霉毒素與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)抗體，在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物。洗除多余抗體成分，加入酶標(biāo)Ⅱ抗，與抗體反應(yīng)通過(guò)酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來(lái)判斷樣品中黃曲霉毒素的含量。

ELISA具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)、成本低等特點(diǎn)，大大減輕了工作人員的勞動(dòng)量，樣品不需特殊處理，直接測(cè)定，儀器操作簡(jiǎn)單，適合于AFM1大批樣品的檢測(cè)篩選，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。我國(guó)DB33/T 556-2005乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測(cè)定使用酶聯(lián)免疫吸附法，ISO 14675：2003（IDF186：2003）牛奶和牛奶制品，競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)化描述指南.黃曲霉毒素M1含量的測(cè)定即為ELISA法[14，15]。競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)從1995年起已成為AOAC檢測(cè)黃曲霉毒素的官方方法。

3.4.2 膠體金法 膠體金法基于競(jìng)爭(zhēng)法膠體金免疫層析技術(shù)，用于快速篩查含有AFM1 的液態(tài)奶、奶粉（含嬰兒奶粉）和飼料等樣品。此法將檢測(cè)樣品液加入速測(cè)卡上的樣品孔，檢測(cè)液中的AFM1與金標(biāo)卡上的金標(biāo)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，若AFM1在檢測(cè)液中濃度低于設(shè)定檢測(cè)靈敏度值（陰性樣本），未結(jié)合的金標(biāo)抗體流到T區(qū)時(shí)，被固定在膜上的抗原捕獲，形成一條可見(jiàn)的T線；若AFM1 濃度高于設(shè)定檢測(cè)靈敏度值，金標(biāo)抗體即與AFM1全部形成復(fù)合物，不再與T線處抗原結(jié)合，T線不可見(jiàn)。C線為質(zhì)控線，出現(xiàn)則說(shuō)明該速測(cè)卡有效。鄧省亮等[16]、孫秀蘭等[17]等分別制備和研究了膠體金檢測(cè)卡以及樣品基質(zhì)對(duì)試紙條信號(hào)靈敏度的影響，并為消除這些影響提供了經(jīng)驗(yàn)。市面上的速測(cè)卡盒在2～8 ℃可穩(wěn)定保存4個(gè)月，檢測(cè)一個(gè)樣品費(fèi)用僅需幾十元。此方法快速便捷，操作簡(jiǎn)單，成本低，適用于大量篩查牛奶中AFM1，節(jié)省了人力、物力、財(cái)力。

3.4.3 SNAP法 利用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)原理，樣品中殘留的黃曲霉毒素M1與定量特異性酶標(biāo)抗體反應(yīng)，多余的游離酶標(biāo)抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，通過(guò)流動(dòng)洗滌，加入酶顯色底物顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比較定性。GB 5413.37～2010 乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定（第四法）和NY 1664～2008 牛乳中黃曲霉毒素M1的測(cè)定均采用此法[12，18]。

4 小結(jié)

目前， 人們逐漸認(rèn)識(shí)到牛乳具有提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)， 已成為不可缺少的常用食品，牛奶的安全性也日益受到重視，所以對(duì)于牛奶中AFM1的污染控制是牛奶生產(chǎn)中的重中之重。

薄層層析法是經(jīng)典方法，一般實(shí)驗(yàn)室均能完成，雖不斷改進(jìn)，但在抗干擾、精密度方面仍有缺陷，且步驟繁瑣，對(duì)人員危害大。親和柱HPLC-FLD靈敏度、精密度等均可滿足AF檢測(cè)要求。HPLC-MS具有預(yù)處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可以滿足少量和批量樣品的檢測(cè)需要，但對(duì)于儀器要求較高，成本也較高。免疫層析凈化熒光分光度法測(cè)定過(guò)程中不使用AFM1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，避免污染危險(xiǎn)，具有準(zhǔn)確、快速、安全、簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。根據(jù)其特點(diǎn)這幾種方法適合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。ELISA、膠體金法和SNAP法適合于現(xiàn)場(chǎng)篩查。ELISA使用安全，操作簡(jiǎn)便、快捷，適合大批量樣品篩查，但適用酶、抗體對(duì)保存條件、時(shí)間又有一定要求。膠體金法和SNAP法更加方便快捷，但主要用于定性。此外，乳及乳制品特別是生乳的貯存條件特殊，不宜長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸貯存，快速檢測(cè)對(duì)大規(guī)模監(jiān)測(cè)具有重要意義。同時(shí)，快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)可以提高檢測(cè)效率，加大監(jiān)測(cè)范圍和力度，保證牛奶質(zhì)量安全。采用快速檢測(cè)技術(shù)（最好是膠體金速測(cè)卡）初步篩查后，再用HPLC-FLD法、HPLC-MS法等定量法對(duì)快速法篩選出的陽(yáng)性或超標(biāo)樣品進(jìn)一步確證，這可能是解決大批量牛奶檢測(cè)的最好方法。

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