張又文　寸湘竹　張可夫等

組織工程是應(yīng)用工程學(xué)及生命科學(xué)原理和方法，實(shí)現(xiàn)組織保存、修復(fù)、功能維持和提高作用的生物學(xué)替代物的科學(xué)，目的是實(shí)現(xiàn)組織器官的功能修復(fù)。干細(xì)胞不僅可用于再生醫(yī)學(xué)、組織工程，還可應(yīng)用于生物生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的研究、藥物篩選、基因治療等領(lǐng)域。因核移植技術(shù)以及提取胚胎干細(xì)胞面臨著材料不易獲取、免疫排斥和倫理學(xué)爭(zhēng)議，其研究發(fā)展受限。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced Pluripotent stem cells，iPSC）是將影響全能性的外源轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)敕只捏w細(xì)胞誘導(dǎo)其重編程成為類似于胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESC）的多能干細(xì)胞。iPSC制備技術(shù)不需要胚胎和卵母細(xì)胞，克服了以上限制，應(yīng)用前景廣闊。

1 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的產(chǎn)生

2006年，Takahashi等[1]將24種與全能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子排列組合，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞，并通過Fbxl5報(bào)告基因（細(xì)胞多能性標(biāo)志分子）篩選，確定了4種轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4可將成纖維細(xì)胞重編程為iPSC，其在細(xì)胞形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、生長(zhǎng)特性、標(biāo)志物等方面與小鼠ESC十分相似。這些iPSC能形成畸胎瘤和嵌合體小鼠胚胎，但是不能形成成活嵌合體小鼠并參與到生殖遺傳。后來(lái)，Okita等[2]改選Nanog進(jìn)行篩選建立的iPS細(xì)胞系相比Fbx15篩選得到的iPSC在基因表達(dá)譜和DNA甲基化模式上與ESC更接近，且能夠參與成活的嵌合體小鼠生殖系細(xì)胞的遺傳。2007年，Takahashi等[3]建立了人iPSC，美國(guó)Thomson實(shí)驗(yàn)室[4]同時(shí)報(bào)道通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct4，Sox2，Nanog及Lin28四個(gè)基因也能將新生兒包皮成纖維母細(xì)胞成功重編程為iPSC。隨后，多種來(lái)源體細(xì)胞都被重編程為iPSC。

2 iPS細(xì)胞制備技術(shù)的優(yōu)化

2.1轉(zhuǎn)錄因子的選擇：選擇轉(zhuǎn)錄的除了由其本身的全能性決定外，還可根據(jù)加入的小分子化合物和體細(xì)胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平等多方面綜合考慮進(jìn)行優(yōu)化。Kim等[5]發(fā)現(xiàn)Oct4是必需的，外源Sox2、Klf4 和c-Myc 表達(dá)不是iPSC產(chǎn)生的必要條件，其作用是提高誘導(dǎo)效率。增加轉(zhuǎn)錄因子使用個(gè)數(shù)，如：采用六因子（Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-Myc和Klf4）可顯著提高重編程效率[6]，然而轉(zhuǎn)錄因子作為外源基因?qū)PSC的安全也構(gòu)成了威脅。小分子化合物可替代某些轉(zhuǎn)錄因子并提高重編程效率，其機(jī)制可能是小分子化合物誘導(dǎo)內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，因此有利于安全性的提高。Huangfu等[7]在對(duì)組蛋白脫乙?；敢种苿?丙戊酸（VPA）的一系列研究發(fā)現(xiàn)，利用VPA可以使只有Oct4、Sox2轉(zhuǎn)錄因子的體細(xì)胞成功誘導(dǎo)為iPSC。對(duì)于小分子化合物的研究加深了對(duì)重編程的信號(hào)通路和分子機(jī)制的研究，使我們能更好地理解體細(xì)胞重編程機(jī)制。研究已發(fā)現(xiàn)有效的小分子化合物還有Vit C、PD0325901、CHIR99021、P53 siRNA和UTF1等，均可提高iPSC產(chǎn)生效率。

2.2外源因子導(dǎo)入方式：逆轉(zhuǎn)錄病毒是首次產(chǎn)生iPSC所使用的載體，以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為載體的轉(zhuǎn)染方式會(huì)使外源基因和載體序列整合。多病毒整合位點(diǎn)引起的插入突變會(huì)干擾正常基因功能，而外源基因的表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞分化，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。2008年，Stadtfeld等[8]和Okita等[9]分別使用腺病毒和質(zhì)粒來(lái)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，成功獲得無(wú)外源基因整合的iPS細(xì)胞，但誘導(dǎo)效率低下。2009年，研究者[10-12]利用Cre/LoxP 重組系統(tǒng)，oriP/EBNA1質(zhì)粒和piggy-Bac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將外源基因從iPS細(xì)胞中切除，這些方法較為繁瑣，安全性也有待驗(yàn)證。直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子蛋白或mRNA，被認(rèn)為是最安全的方法，在重編程因子蛋白上連接細(xì)胞穿膜肽組成融合蛋白，可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，執(zhí)行其重編程的功能，蛋白誘導(dǎo)小鼠和人體的iPSC都已實(shí)驗(yàn)成功[13]。但是其誘導(dǎo)效率低，且蛋白容易失活。Warren等[14]將4個(gè)產(chǎn)生重編程蛋白的mRNA導(dǎo)入細(xì)胞以誘導(dǎo)iPS細(xì)胞，這種方法效率較高，誘導(dǎo)時(shí)間也只需原來(lái)的一半。

2.3 體細(xì)胞的選擇：不同分化階段的體細(xì)胞，在重編程的難易程度、效率、所需因子組合或克隆形成所需時(shí)間等方面上是不同的。分化程度低的體細(xì)胞，如：神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞，其重編程大大易于終末分化的體細(xì)胞。同時(shí)有研究顯示不同來(lái)源的iPSC在腫瘤形成上存在很大差異。Aoi等[15]發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPSC成瘤性比肝臟細(xì)胞和胃表皮細(xì)胞來(lái)源的iPSC成瘤性要高很多。Sun等[16]發(fā)現(xiàn)采用人脂肪干細(xì)胞作為供體細(xì)胞，效率是皮膚成纖維細(xì)胞的20倍，原因可能是脂肪干細(xì)胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)。也有研究[17]采用血細(xì)胞來(lái)獲得iPS細(xì)胞，使得其產(chǎn)生方式更為便捷。此外，Yoshida等[18]發(fā)現(xiàn)5%低氧濃度的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境可有效提高iPSCs的誘導(dǎo)效率。隨著對(duì)多種體細(xì)胞重編程及其機(jī)制的研究，將有望找到兼具高效、安全、易于取材等優(yōu)點(diǎn)的供體細(xì)胞。

2.4 iPSC的篩選鑒定：從最開始的Fbx15到選用Nanog或Oct4篩選出與ESC更類似的iPSC，報(bào)告基因篩選法都需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)修飾。后來(lái)，Maherali等[19]利用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選鑒定，然而形態(tài)學(xué)的篩選工作量大，需要研究者豐富的ESC培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)。現(xiàn)在一般從形態(tài)學(xué)、分子和功能水平上進(jìn)行系統(tǒng)地篩選鑒定。在功能上主要是形成畸胎瘤、形成嵌合體、擁有生殖系遺傳能力以及產(chǎn)生四倍體能力的鑒定，然而除了畸胎瘤生成，其余鑒定方式都面臨倫理問題，不方便應(yīng)用于人類iPSC。

3 iPSC的應(yīng)用

構(gòu)建人類疾病的動(dòng)物模型，用于細(xì)胞替代治療的研究。2007年，Hanna等[20]利用人類鐮狀細(xì)胞性貧血的小鼠動(dòng)物模型，取尾尖成纖維細(xì)胞重編程為iPSC，然后通過同源重組的方法用人野生型βA-珠蛋白基因替代了βS- 珠蛋白基因，接著將修飾過的iPSC定向分化為造血干細(xì)胞，移植后治療動(dòng)物模型的鐮狀細(xì)胞性貧血。美國(guó)學(xué)者Wernig等[21]將體外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)前體細(xì)胞移植進(jìn)人小鼠胎腦，形成的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞具有良好的功能和活性，進(jìn)一步研究證明移植體外分化的多巴胺能神經(jīng)元可以明顯改善成年帕金森病模型鼠的運(yùn)動(dòng)功能。Xu等[22]用iPSC分化而來(lái)的內(nèi)皮前體細(xì)胞移植入血友病A的模型小鼠肝臟中，有效改善了出血不止的癥狀。此外還有多項(xiàng)研究將iPSC在體外定向分化為原始生殖細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、β細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。這都顯示了極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

此外，人類疾病特異性iPS細(xì)胞系的建立，為個(gè)性化的治療提供了可能。2008年，Dimos等[23]將一患有家族性肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）的82歲患者的皮膚成纖維細(xì)胞成功誘導(dǎo)成iPSC，并分化成帶有疾病特征的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，該模型的建立可以研究ALS的發(fā)病機(jī)制，提供尋找合適藥物靶點(diǎn)，篩選治療ALS的藥物，還可能用于通過遺傳修飾得到正常功能的自體神經(jīng)元進(jìn)行移植治療。Park等[24]也建立了多種遺傳病患者的特異性的iPS細(xì)胞系包括脊髓性肌萎縮（SMA），亨廷頓病，唐氏綜合癥等。

4 iPS細(xì)胞的問題與展望

目前，提高iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率和安全性以使其應(yīng)用于臨床醫(yī)療是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，同時(shí)iPS細(xì)胞還有許多問題需要解答，如：①iPS細(xì)胞的體外定向分化不明，許多實(shí)驗(yàn)都產(chǎn)生了畸胎瘤或腫瘤；②篩選和鑒定iPS細(xì)胞的方法還不夠完善，尤其是在人iPS細(xì)胞的鑒定上；③需要兼顧重編程效率和安全性，考慮僅利用mRNA、蛋白或小分子化合物來(lái)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞；④需要找出最合適的供體細(xì)胞；⑤重編程機(jī)制以及iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞在表觀遺傳修飾和基因表達(dá)譜的差異；⑥倫理爭(zhēng)議：iPS細(xì)胞的全能性使得產(chǎn)生克隆個(gè)體成為可能，這會(huì)使iPS細(xì)胞重新面臨倫理學(xué)上的爭(zhēng)議。雖然iPS細(xì)胞現(xiàn)在所面臨的問題仍亟待解決，但隨著研究的深入，iPS細(xì)胞有望與胚胎干細(xì)胞一樣，被廣泛應(yīng)用于骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)、上皮、脂肪、血管內(nèi)皮組織工程，最終投入到臨床上的各類缺損組織修復(fù)及美容手術(shù)。

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[收稿日期]2013-02-20 [修回日期]2013-04-11

編輯/李陽(yáng)利