李澤鍵　賴仁發(fā)

目前，臨床上對(duì)于骨移植材料的需求量日益增加，各種類型的骨移植材料已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)研究中取得了一定的成效并逐漸進(jìn)入臨床應(yīng)用研究階段，評(píng)價(jià)骨移植材料成骨效能的指標(biāo)也愈來愈多樣化，各項(xiàng)指標(biāo)之間各有側(cè)重，從不同的角度反映材料的骨修復(fù)能力。本文通過檢索近幾年的相關(guān)研究文章，對(duì)各項(xiàng)評(píng)價(jià)骨材料成骨效能的檢測(cè)指標(biāo)及其對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法做了如下總結(jié)。本文將成骨效能的檢測(cè)指標(biāo)歸納為新骨形成，微血管形成，成骨活性標(biāo)志物的表達(dá)，骨組織形態(tài)及生物強(qiáng)度檢測(cè)等幾個(gè)方面，根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)的需要，對(duì)各種特異性檢測(cè)方法也作了總結(jié)，現(xiàn)綜述如下。

1 新骨形成與骨組織形態(tài)的檢測(cè)

1.1 影像學(xué)檢測(cè)：X-ray是最常見，也是最原始的檢測(cè)方法，早在1896年便開始應(yīng)用于醫(yī)學(xué)影像，是目前醫(yī)學(xué)診斷的重要手段之一。目前，研究者在使用X-ray的同時(shí)，多采用一些定量或半定量的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)X-ray顯像結(jié)果進(jìn)行定量分析、比較。竇洪磊等[1]應(yīng)用X-ray結(jié)合Lane-Sandhu評(píng)分系統(tǒng)對(duì)同種異體骨移植修復(fù)大段骨缺損療效進(jìn)行檢測(cè)，將X-ray顯像結(jié)果通過計(jì)分轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與比較。Mahesh等[2]采用X-ray結(jié)合Kuznetsov半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)成骨情況，同樣將X-ray檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)化為計(jì)分，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析比較。

螺旋CT三維重建在骨缺損修復(fù)療效的檢測(cè)方面目前應(yīng)用較多，利用多層螺旋CT進(jìn)行圖像分析和骨密度測(cè)定可以更直觀地了解骨組織缺損重建后局部組織再礦化的程度。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已應(yīng)用定量CT進(jìn)行三位的骨密度測(cè)量，并取得了一定成果[3-4]。多層螺旋CT 技術(shù)能將骨皮質(zhì)和骨松質(zhì)的圖像顯示得更加清晰，通過調(diào)整圖像能使人眼更易觀察到細(xì)微的灰度變化，以便更加精確和全面地對(duì)冠狀位、矢狀位和橫斷面的三維CT圖像進(jìn)行測(cè)量，準(zhǔn)確反映局部骨密度變化；螺旋CT圖像不僅可以通過不同灰階度顯示其密度的高低，還可用組織對(duì)X射線的吸收系數(shù)反映其密度高低的程度，即CT 值。Maki等[5]通過體外試驗(yàn)顯示，CT值與羥基磷灰石濃度有較高的相關(guān)性。Norton等[6]及Shahlaie等[7]亦認(rèn)為CT值用于對(duì)缺損區(qū)修復(fù)再造后骨密度的評(píng)價(jià)具有一定的價(jià)值，可以用CT測(cè)量值來預(yù)測(cè)骨密度。

CBCT是近幾年新發(fā)展的檢測(cè)技術(shù)，它具有一次掃描、三維成像，三維影像更加清晰，最小分辨率可達(dá)到0.125mm，并可以實(shí)時(shí)顯示橫縱斷面的三維影像，使得成骨效能的檢測(cè)更加全面、直觀、可靠。隨著CBCT在口腔醫(yī)學(xué)影像診斷學(xué)的發(fā)展應(yīng)用，已有不少研究者將CBCT應(yīng)用于頜面骨缺損修復(fù)效果的檢測(cè)。劉苗等[8]應(yīng)用CBCT觀察人工骨對(duì)兔下頜骨缺損的修復(fù)效果，得到清晰的三維圖像，能夠多角度多層面地觀察下頜骨缺損修復(fù)后的成骨情況，提示CBCT作為骨效能檢測(cè)手段的可行性。Roe等[9]及Kim等[10]也應(yīng)用CBCT評(píng)價(jià)骨缺損修復(fù)的效果，認(rèn)為CBCT在骨檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.2 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)：伊紅-蘇木素染色法 （hematoxylin-eosin staining），簡(jiǎn)稱HE染色法，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一，科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。其原理是去氧核糖核酸（DNA）帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液呈灰藍(lán)色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽離子結(jié)合使胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明對(duì)比。目前，HE染色不僅應(yīng)用于骨組織標(biāo)本的定性分析，也結(jié)合一些評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量分析，如有學(xué)者采用HE染色結(jié)合Nibson骨缺損組織形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)骨組織形態(tài)進(jìn)行定量分析取得了不錯(cuò)的效果[11-12]。

茜素紅染色（alizarin red S staining）同樣也是一種鈣結(jié)節(jié)的特異性染色方法，其原理是茜素紅能夠與鈣離子發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的鰲和物，用以識(shí)別組織細(xì)胞的鈣鹽成分，將沉積的鈣鹽結(jié)節(jié)染成深紅色，主要適用于動(dòng)物原生代或培養(yǎng)細(xì)胞的鈣沉積和鈣化結(jié)節(jié)檢測(cè)。但它的缺點(diǎn)是容易受到其它金屬元素的干擾。目前，大量的國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞表明鈣鹽的沉積及新骨組織中鈣結(jié)節(jié)的檢測(cè)均傾向于采用茜素紅染色，充分體現(xiàn)其檢測(cè)的特異性及可靠性[13-16]。

1.3骨密度及骨礦化檢測(cè)：骨密度（bone mineral density， BMD），全稱“骨骼礦物質(zhì)密度”。影像學(xué)領(lǐng)域的骨密度是指單位骨體積或面積的平均骨礦物質(zhì)含量， 是反映骨質(zhì)量的重要指標(biāo)。早期、精確地BMD檢測(cè)可以及時(shí)了解骨質(zhì)的變化。目前主要是使用骨密度儀對(duì)BMD進(jìn)行檢測(cè)，通過測(cè)定人體骨礦并獲得各項(xiàng)相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果數(shù)據(jù)以T值為主，還包括Z值、骨密度、骨量等數(shù)據(jù)，目前市場(chǎng)上主流的骨密度儀分為雙能X射線骨密度儀和超聲骨密度儀兩大類，其中以雙能X線方式測(cè)試的結(jié)果較準(zhǔn)確，是國(guó)際衛(wèi)生組織（WHO）采用的骨密度金標(biāo)準(zhǔn)。雙能X射線骨密度儀可測(cè)量全身任何部位的骨量，精確度高，對(duì)人體危害較小，測(cè)得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于骨移植材料成骨效能的檢測(cè)。Gautam等[17]采用骨密度儀檢測(cè)復(fù)合骨移植材料的峰值骨量，測(cè)得新骨組織的礦化程度及新骨形成率、礦化率等指標(biāo)，從而精確、定量地反映了移植材料的成骨效能。Chen等[18]采用雙能X射線骨密度儀檢測(cè)一種中藥提取物復(fù)合材料移植大鼠牙槽骨后的BMD，從而反映了實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組明顯的成骨作用。此外，Xie等[19]采用了另外一種檢測(cè)方法—Micro-CT檢測(cè)骨組織的BMD，同樣證實(shí)了骨移植材料量化的成骨效能。

2 成骨活性標(biāo)志物的表達(dá)檢測(cè)

2.1 堿性磷酸酶：堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP） 是廣泛分布于人體骨骼組織的一種酶，它不是單一的酶，而是一組同功酶，目前已發(fā)現(xiàn)有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5與ALP6六種同功酶。ALP確切的生理作用目前仍不十分清楚，但它在骨組織中相當(dāng)活躍，一般認(rèn)為骨中ALP和骨的鈣化作用密切相關(guān)，成骨細(xì)胞中的ALP作用產(chǎn)生磷酸，與鈣生成磷酸鈣沉積于骨中。因此，檢測(cè)ALP的活性程度，可以反映成骨過程中的鈣鹽沉積情況。李曉峰等[13]利用堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)移植骨的ALP活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞可見藍(lán)黑色顆粒沉積在胞漿堿性磷酸酶活性部位。Chen等[18]，Li等[20]及Kim等[21]通過免疫印跡等方法檢測(cè)ALP的活性來評(píng)價(jià)骨移植材料的成骨效能。

2.2 骨鈣素/骨鈣蛋白：骨鈣素（bone gamma- carboxyglutamic-acid-containing proteins，BGP）又稱骨鈣蛋白（osteocalcin），該蛋白在骨礦化峰期之后才出現(xiàn)積聚，由成骨細(xì)胞合成并分泌，不受骨吸收因素的影響。通過檢測(cè)血清骨鈣素水平可以了解成骨細(xì)胞，特別是新形成的成骨細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)。骨鈣素值隨骨更新率的變化而不同，骨更新率越快，骨鈣素值越高，反之降低。Chen等[18]通過ELISA法檢測(cè)骨鈣蛋白的含量，從而評(píng)價(jià)骨移植材料在骨修復(fù)過程中的成骨效應(yīng)。賈春蓉等[22]采用125I 放免法檢測(cè)細(xì)胞上清液中骨鈣素含量，從而評(píng)價(jià)研究對(duì)象的成骨活性。

3 骨組織生物學(xué)強(qiáng)度檢測(cè)

修復(fù)骨缺損不僅要恢復(fù)骨形態(tài)的連續(xù)，重要的是重建骨的支撐功能，這就要求骨移植材料的生物力學(xué)性能應(yīng)盡可能達(dá)到正常骨皮質(zhì)的力學(xué)性能。李明等[11]于移植后16周對(duì)移植骨塊進(jìn)行生物力學(xué)三點(diǎn)抗彎曲實(shí)驗(yàn)載荷、彎曲應(yīng)力檢測(cè)， 實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組新骨生成有顯著性差異，而與正常骨組織之間無顯著性差異。簡(jiǎn)月奎等[23]對(duì)植入后24周的移植骨塊進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示移植骨塊的抗壓縮壓強(qiáng)及極限壓強(qiáng)、抗彎曲載荷及極限載荷、抗扭轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)矩及極限轉(zhuǎn)矩與自體骨組及正常骨組均基本相似。

4 小結(jié)與展望

隨著對(duì)各種組織工程骨移植材料的深入研究，對(duì)于各種檢測(cè)指標(biāo)及方法的應(yīng)用也逐漸成熟。但是，目前現(xiàn)有的檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法尚未形成一定的體系與標(biāo)準(zhǔn)，一些檢測(cè)指標(biāo)的金標(biāo)準(zhǔn)尚未確定。另外，對(duì)骨材料移植后成骨效能的檢測(cè)仍較大程度地停留在離體組織的靜態(tài)檢測(cè)，對(duì)于活體成骨效能的動(dòng)態(tài)檢測(cè)指標(biāo)及方法仍有待進(jìn)一步研發(fā)。

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[收稿日期]2012-12-01 [修回日期]2013-03-26

編輯/李陽利