潘麗杰　陳妍　袁杰

[摘要]目的：分離培養(yǎng)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（ human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells， hUCB-MSC），體外觀察其生長(zhǎng)特性，并在特定條件下誘導(dǎo)分化，探討其成脂成骨分化能力。方法：采用沉降法和密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法自臍血中分離間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)及生長(zhǎng)情況；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期并檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物；用茜素紅染色和油紅O染色分別鑒定其成骨成脂分化能力。結(jié)果：純化的hUCB-MSC貼壁生長(zhǎng)，呈均一梭形，具有較強(qiáng)的增值能力，流式細(xì)胞儀分析P3代hUCB-MSC穩(wěn)定表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志 CD73，CD105 和 CD90 等，不表達(dá)造血標(biāo)志 CD34 和 CD45；成骨誘導(dǎo)后3周后細(xì)胞茜素紅染色陽(yáng)性；成脂誘導(dǎo)3周后細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)分離的hUCB-MSC具有較強(qiáng)的增殖能力，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記， 具有成骨成脂分化潛能。

[關(guān)鍵詞]臍血；間充質(zhì)干細(xì)胞；分化；鑒定

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）07-0735-04

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），作為一種成體干細(xì)胞用于再生醫(yī)學(xué)修復(fù)各種間葉組織如骨、軟骨、肌肉等，具有廣闊的發(fā)展空間[1-2]，目前應(yīng)用較為廣泛為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但由于骨髓取材屬有創(chuàng)操作且干細(xì)胞隨供體年齡增大有老化傾向等問(wèn)題，在一定程度上限制其臨床應(yīng)用[3]。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，臍血干細(xì)胞來(lái)源廣泛，采集方便，不會(huì)對(duì)供者造成任何傷害，且有研究顯示患者接受異體移植后，臍血來(lái)源的MSCs顯示出更低的免疫原性反應(yīng)[4-5]所以人臍血MSCs引起越來(lái)越多研究者的廣泛興趣。但是關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的含量及能否成功體外培養(yǎng)存在很大爭(zhēng)議。因此，本實(shí)驗(yàn)即探討hUCB-MSCs的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性，以期建立穩(wěn)定的體外分離培養(yǎng)體系；同時(shí)對(duì)其體外誘導(dǎo)分化能力也進(jìn)行深入研究，以期為下一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料：所有標(biāo)本均取自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科順產(chǎn)及剖宮產(chǎn)的胎兒，孕婦體健，乙肝五項(xiàng)、梅毒等檢測(cè)均為陰性，胎兒無(wú)先天性疾病，取血前征得產(chǎn)婦及家屬同意并簽署知情同意書(shū)。0.25%胰蛋白酶/EDTA、DMEM/F12（美國(guó)， Hyclone），胎牛血清FBS（美國(guó)，Gibco），人淋巴細(xì)胞分離液（1.077 g/ml，天津TBD公司），地塞米松、維生素C、吲哚美辛、β-甘油磷酸鈉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和胰島素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。熒光標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體：CD45-PE、CD34-APC、CD90-FITC、 CD105-FITC和CD73-PE均購(gòu)自美國(guó)biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 hUCB-MSC的分離與培養(yǎng)[6]：經(jīng)新生兒父母同意，采集新生兒臍血12份，每份50～80 ml，將所采集樣本于4h內(nèi)處理。將抗凝臍血用同體積的PBS稀釋一倍，混勻，再與37℃預(yù)溫的3%明膠等比混合，室溫下靜置至血漿與紅細(xì)胞界面形成后，吸取血漿層，2000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；用5 ml DMEM/F12重懸所得細(xì)胞，按2：1的體積比加到人淋巴細(xì)胞分離液（1.077g/ml）表面，2000 r/min離心20 min，離心后吸取懸于分離液面的白膜層，獲得單個(gè)核細(xì)胞。PBS洗兩次，用DMEM/F12培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、10μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、100U/mL青霉素和100 g/L的鏈霉素）懸浮上述細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以1×107cells/ml濃度接種于25ml培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4天后首次換液，以后每3天換液一次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，1：1傳代。第一代后細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到 80%～90%時(shí)按 1：3傳代。選用生長(zhǎng)良好的P3代細(xì)胞做鑒定。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：取P3代細(xì)胞，0.25%胰酶/EDTA消化，制備單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，70%冰乙醇固定30 min，PBS洗2次，40mg/L RNAse中處理后離心，加入10g/L碘化丙啶0.5ml，染色30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.3 hUCB-MSC表面標(biāo)志的檢測(cè)：取P3代細(xì)胞，在細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，0.25%胰酶/EDTA消化，制備單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，PBS洗兩次，離心，棄上清，加入0.1mlPBS重懸，分別加入熒光標(biāo)記的抗體及同型對(duì)照，室溫避光孵育 20min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD90、CD105和CD73、CD45和CD34的表達(dá)情況。

1.2.4 hUCB-MSC分化能力檢測(cè)：①成骨誘導(dǎo)：取P3代細(xì)胞以5×104個(gè)/ml 接種于六孔板，用含10% FBS的 DMEM/F12 培養(yǎng) 24h，待細(xì)胞貼壁伸展后，實(shí)驗(yàn)組換用礦化誘導(dǎo)液（含10nmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50μg/ml 維生素C，1×10-7mol/L地塞米松、10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基），對(duì)照組僅用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔3天換液。鏡下觀察細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)并出現(xiàn)黃褐色結(jié)節(jié)后棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，1%茜素紅染色10min，鏡檢、照相；②成脂誘導(dǎo)：將P3代細(xì)胞以 5×104個(gè)/ml的密度接種于六孔板，用含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁伸展后，換用成脂誘導(dǎo)液（含0.25μmol/L 地塞米松，0.5mmol/L IBMX，100mmo1/L 吲哚美辛，10μg/L 胰島素， 10% FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基），對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑，每隔3天換液。鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪小滴后棄去成脂誘導(dǎo)液，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min，油紅O染色15min，顯微鏡下觀察、照相。

2 結(jié)果

2.1 hUCB-MSC形態(tài)學(xué)觀察：原代培養(yǎng)初期含有多種細(xì)胞成分，大部分細(xì)胞未貼壁，細(xì)胞為圓形或球形血細(xì)胞，第4天可見(jiàn)散在單個(gè)細(xì)胞貼壁，呈卵圓形，紡錘形和短梭形，逐漸伸出細(xì)胞突起，但無(wú)明顯擴(kuò)增；10天以后細(xì)胞體積增大，密度明顯增加，少數(shù) MSCs 呈多角形，大部分呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞突起明顯，且向周圍伸展呈輻射狀和網(wǎng)狀生長(zhǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)約3～4周可達(dá)80%～90%融合即可傳代。傳代hUCB-MSC接種后 6～8h即可貼壁，細(xì)胞均勻散在分布，生長(zhǎng)迅速，1周后可再次傳代。隨著換液和傳代，異質(zhì)性細(xì)胞逐漸被去除，貼壁細(xì)胞呈均一的成纖維樣細(xì)胞，呈旋渦狀生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

2.4 hUCB-MSC分化能力鑒定：①成骨誘導(dǎo)：hUCB-MSCs 成骨誘導(dǎo) 1周時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；3周時(shí)可見(jiàn)鈣化物形成，茜素紅染色可見(jiàn)胞漿中有大量的紅色鈣化基質(zhì)沉積，對(duì)照組無(wú)此變化，見(jiàn)圖 3；②成脂誘導(dǎo)：hUCB-MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)1周，生長(zhǎng)明顯減慢， 細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變得豐滿，胞體變大，胞漿豐富，誘導(dǎo)2周左右在細(xì)胞核周圍的胞漿內(nèi)出現(xiàn)一些折光性強(qiáng)的圓形脂肪小滴。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪滴逐漸增多并融合成大脂肪滴。3周后固定，1%油紅O 染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有紅染脂滴，大小不等，部分脂滴發(fā)生融合，主要分布在細(xì)胞核周圍及其附近，對(duì)照組無(wú)此變化，見(jiàn)圖3。

3 討論

實(shí)驗(yàn)在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，首先選用含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM/F12作為培養(yǎng)基，并加入bFGF，主要考慮以往試驗(yàn)中已經(jīng)證明DMEM/F12能夠提高培養(yǎng)效率[7]，而bFGF在間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要的作用[8]，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞貼壁。原代培養(yǎng)hUCB- MSC，主要有兩種形態(tài)的貼壁細(xì)胞：一類呈橢圓形或圓形，體積大，這類細(xì)胞不能進(jìn)一步增殖達(dá)到融合，最終趨于死亡。Erices等[7]認(rèn)為此類細(xì)胞可能來(lái)源于臍血的破骨祖細(xì)胞，Wexler等[9]認(rèn)為這群細(xì)胞表達(dá)了造血干細(xì)胞標(biāo)志，為造血干細(xì)胞來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為這類細(xì)胞來(lái)源于造血干細(xì)胞的可能性比較大，因?yàn)榉蛛x的單個(gè)核細(xì)胞大部分為造血干細(xì)胞，在培養(yǎng)中極易分化出造血系的細(xì)胞；另一類細(xì)胞呈均勻一致的長(zhǎng)梭形，12份臍血標(biāo)本有8份在第10天后出現(xiàn)大量MSCs，而圓形細(xì)胞很少，且MSCs增殖迅速，逐漸融合，傳代后生長(zhǎng)也很迅速，傳3代后圓形細(xì)胞基本不見(jiàn)，剩下形態(tài)較為均一的漩渦樣生長(zhǎng)的纖維樣細(xì)胞，即hUCB-MSC。流式分析顯示約近80%處于細(xì)胞周期的G0/G1期。這些細(xì)胞自我更新能力很強(qiáng)，表現(xiàn)為細(xì)胞在傳代后增殖迅速，可傳至第18代，與Goodwin 等[10]報(bào)道一致。

目前，間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定一般有兩種方法，其一是通過(guò)表面標(biāo)志物檢測(cè)，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)造血干細(xì)胞的CDl4，CD34，CD45，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞CD31，CDl44；表達(dá)CDl3，CD29，CD44，SH2（CDl05），SH3（CD73），CD90，SH4，HLA-I等[11]；另一種是從功能學(xué)上鑒定，即根據(jù)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，在特定培養(yǎng)基中呈纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，表現(xiàn)為幼稚細(xì)胞的特性，能夠分化為至少兩種不同的子代細(xì)胞。結(jié)合上述兩種方法，本實(shí)驗(yàn)中流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示所分離培養(yǎng)的成纖維樣細(xì)胞表達(dá) CD73、CD105、CD90，不表達(dá)造血細(xì)胞相關(guān)抗原 CD34、CD45，證明這些細(xì)胞是區(qū)別于造血細(xì)胞且具有高度增殖能力的處于未分化狀態(tài)的非定向干細(xì)胞。為進(jìn)一步確定所純化的MSCs是否具有多向分化潛能，分別進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示誘導(dǎo)3周后檢測(cè)到鈣化基質(zhì)的沉淀與脂滴的形成，證明所培養(yǎng)MSCs具有多向分化潛能。

牙再生是利用組織工程原理形成組織、形態(tài)和功能與天然牙一樣或相似的礦化組織。其中種子細(xì)胞是牙再生的基礎(chǔ)與關(guān)鍵，目前牙源性干細(xì)胞為主要來(lái)源，但因其來(lái)源困難限制其應(yīng)用，非牙源性干細(xì)胞如骨髓、脂肪、真皮來(lái)源的MSC逐漸被應(yīng)用于牙再生研究。由于具有來(lái)源廣泛，易獲取且無(wú)倫理學(xué)限制，增殖分化能力更強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前有研究呼吁將臍血間充質(zhì)干細(xì)胞作為牙再生種子細(xì)胞進(jìn)行研究[12]。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)建立臍血間充質(zhì)干細(xì)胞系，并探討其生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明體外分離的hUCB-MSC為長(zhǎng)梭狀成纖維樣細(xì)胞，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志，體外增值活力很強(qiáng)，經(jīng)特定條件誘導(dǎo)，細(xì)胞可向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞方向分化，表明建立的細(xì)胞系為MSC并具有多項(xiàng)分化潛能。下一步我們將利用發(fā)育期牙胚所提供的微環(huán)境誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，探討其牙向分化的可能性。hUCB-MSC可望作為種子細(xì)胞在牙齒再生組織工程學(xué)研究中有廣闊的應(yīng)用前景。

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[收稿日期]2013-02-02 [修回日期]2013-03-28

編輯/張惠娟