王良

摘要：乳酸菌是非常重要的生理菌群，在腸道無毒、無副作用，對人類和動物的身體起著各種重要的生理功能。本研究以企業(yè)提供的樣品為材料，通過劃線、梯度稀釋進行MRS培養(yǎng)基定向的篩選與分離，最終獲得一株優(yōu)良的乳酸菌菌株。

關(guān)鍵詞：酸菜 乳酸菌 篩選

中圖分類號：Q93-331 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2013）14-0041-02

微生態(tài)發(fā)酵食品是一種綠色環(huán)保食品，專門用于食品發(fā)酵的一類微生物添加劑，由乳酸菌、酶和一些營養(yǎng)物組成，主要作用是有目的地調(diào)節(jié)食品內(nèi)微生物區(qū)系，調(diào)控發(fā)酵過程，促進乳酸菌大量繁殖、更快地產(chǎn)生乳酸，促進多糖與粗纖維的轉(zhuǎn)化，從而有效地提高食品的質(zhì)量，所以具有足夠數(shù)量和活力且保證較長貨架壽命的發(fā)酵劑的生產(chǎn)和供應(yīng)成為先決條件。

1 主要儀器及實驗材料

1.1 實驗培養(yǎng)基

（1）液體MRS培養(yǎng)基：酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫80g/L，乙酸鈉5g/L，牛肉粉10g/L，磷酸氫二鉀2g/L，硫酸鎂 0.58g/L，硫酸錳0.25g/L，檸檬酸氫二銨2g/L，蛋白胨10g/L，蒸餾水配制，pH 6.2～6.6。（2）CaCO3MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加0.5%的CaCO3。

1.2 主要儀器

78HW-1恒溫磁力攪拌器，杭州儀表電廠；SY-2-4電熱式恒溫水浴鍋，天津市歐諾儀器儀表有限公司；DT5-1低速離心機，北京時代北利離心機有限公司；78-1磁力加熱攪拌器，上海南匯電訊器材廠；LDZX 50KB高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ALC-2100電子天平，上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 常用溶液 生理鹽水

NaCl：8.5g/L；鹽酸：4%。

1.4 實驗材料

市售酸菜。

2 實驗方法

2.1 菌株的篩選及分離

100mL三角瓶裝30mL生理鹽水，滅菌后待用。4℃冰箱中取出貯存樣品，取3mL裝于裝有30ml蒸餾水的三角瓶中，然后搖床振蕩10min，再靜置5min，即成10-1稀釋度的樣品溶液。按照梯度稀釋法制備10-3的稀釋溶液。取每個梯度的稀釋溶液各200μL，涂于含有CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基平板上，于37℃恒溫箱培養(yǎng)。

菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)的差異挑取菌落，然后接種于液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，并將培養(yǎng)基貼紙記號為S1、S2、S3。再進行梯度稀釋，最后通過菌落劃線等方法，最終獲得單一純化的菌株，保藏。

2.2 菌株鑒定

（1）將篩選到的乳酸菌株劃線接種于含有CaCO3的MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，然后考核菌落的形態(tài)。（2）基因組DNA的提?。喝?7℃恒溫培養(yǎng)2d的菌液，10，000 rpm離心10min，取沉淀，沉淀為菌體。將制備的菌體加入500μL溶菌酶液，37℃保溫1h，1h后補加溶菌酶液100μL，再45℃作用30min，直至透明。將制得得透明溶液加10%的SDS，使?jié)舛冗_到2%，去除雜蛋白，13，000 rpm離心10min。取上清液，再分別用等體積酚、酚：氯仿、氯仿依次進行抽提。上層溶液加等體積異丙醇沉淀10min，再13，000rpm離心15min。沉淀用30μL無菌水溶解，備用。

（1）擴增與分析選用引物p7F和1492R，以分離菌株的基因組DNA為模板，以便擴增。程序設(shè)定為95℃為5min，94℃為1min，50℃為1min，72℃為1min，30個循環(huán)后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物回收純化，進行序列測定。所測得的序列與基因庫中的16SrDNA進行Blast分析。

3 結(jié)果

3.1 乳酸菌的篩選分離

經(jīng)過稀釋涂平板、形態(tài)觀察和16SrDNA檢測等步驟，從企業(yè)提供的樣品中分離得到3種菌株。經(jīng)比較分析，確定S3為乳酸菌，如圖1所示，S1為屎腸球菌（E.faecium）、S2為糞腸球菌（E.faecalis），對S3乳酸菌進一步深入研究。

3.2 菌株的鑒定

（1）菌落形態(tài)觀察：經(jīng)染色，S3為革蘭氏陽性菌；生長良好，呈乳白色，表面光滑（圖1）。經(jīng)觀察，呈球狀，如圖2所示。

（2）16SrDNA保守序列分析：經(jīng)擴增，擴增出1，500bp的16SrDNA片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒的純化，連接到pEASY-T3載體上，選取陽性克隆測序。經(jīng)測序結(jié)果的序列進行拼接，得到16SrDNA序列。經(jīng)Blastn對比，得知所得序列與已報道的Lactobacillus菌株的16SrDNA有100%的一致性，確定其為Lactobacillus。

4 討論

本研究將樣品置于cMRS中，37℃選擇性的增殖了乳酸菌，消除了其他菌體的干擾，通過基因組DNA抽提、16SrDNA保守序列分析及電泳，最終鑒定S3為Lactobacillus。

參考文獻

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