張慶琛 曹靜 裴冬麗 洪權(quán)春 施傳信

摘要：以4個(gè)番茄品種為材料，采用改進(jìn)的氮藍(lán)四唑光還原法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法，研究了經(jīng)聚乙二醇模擬干旱脅迫處理后，番茄幼苗葉片超氧化物歧化酶（SOD）同工酶活性及酶譜的變化。結(jié)果表明，4個(gè)番茄品種的SOD同工酶活性均較對(duì)照明顯增加，各品種的脅迫系數(shù)高低順序依次為中蔬4號(hào)、中雜105、Money maker、中雜9號(hào)；模擬干旱脅迫處理沒有使各品種SOD同工酶酶譜條帶數(shù)目出現(xiàn)增加，仍為3條，SOD同工酶條帶對(duì)干旱響應(yīng)敏感程度的大小排序依次為SOD-Ⅲ、SOD-Ⅱ、SOD-Ⅰ，其中SOD-Ⅲ條帶的酶譜亮度、帶寬在處理與對(duì)照之間均明顯增加，增加程度大小的品種排序依次為中蔬4號(hào)、中雜105、Money maker、中雜9號(hào)，與脅迫系數(shù)一致，說(shuō)明SOD與干旱脅迫密切相關(guān)的同工酶為SOD-Ⅲ，其可能是番茄耐旱品種SOD同工酶活性較高的根源；所以SOD-Ⅲ條帶可作為番茄抗旱生理育種的篩選指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：番茄；聚乙二醇；脅迫；超氧化物歧化酶同工酶

中圖分類號(hào)：S641.2；Q945.78；Q554 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）08-1833-03

干旱是影響作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一，其會(huì)使植株在形態(tài)特征、理化特性方面發(fā)生一系列的變化，導(dǎo)致作物體內(nèi)聚集大量的活性氧等有害物[1]。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）同工酶作為作物響應(yīng)干旱等逆境脅迫的防御性保護(hù)酶之一，可以有效地清除超氧陰離子自由基、防止脂質(zhì)氧化、減少對(duì)膜系統(tǒng)的損傷[2]。SOD廣泛存在于植物體內(nèi)，已有報(bào)道表明在干旱脅迫下會(huì)引起植物SOD同工酶活性[3-5]及酶譜的變化[6]，但未見干旱脅迫對(duì)番茄（Solanum lycopersicum L.）SOD同工酶酶譜影響的報(bào)道。聚乙二醇（Poly ethylene glycol，PEG）是一種高分子滲透劑，能導(dǎo)致作物組織和細(xì)胞處于類似干旱的水分脅迫狀態(tài)之中，但本身不穿越細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，不會(huì)引起質(zhì)壁分離[7]，因此是作物模擬干旱脅迫試驗(yàn)的良好替代品。本試驗(yàn)采用PEG-6000模擬干旱脅迫處理，對(duì)番茄幼苗葉片的SOD同工酶活性及酶譜的變化進(jìn)行了比較，以期揭示其變化規(guī)律，旨在為番茄抗旱生理育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試番茄品種有中雜105（S. lycopersicum cv. Zhongza 105）、中雜9號(hào)（S. lycopersicum cv. Zhongza No.9）、中蔬4號(hào)（S. lycopersicum cv. Zhongshu No.4），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供；另一個(gè)番茄品種Money maker（S. lycopersicum cv. Money maker）由荷蘭瓦格寧根大學(xué)植物育種系提供。

1.1.2 試劑與藥品 主要試劑有乙醇、HgCl2、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑（NBT）、四甲基乙二胺（TEMED）、EDTA-Na2、核黃素等，均為分析純；Hoagland培養(yǎng)液和磷酸鹽緩沖液自配，模擬干旱脅迫用品20% PEG-6000也為分析純。

1.1.3 儀器 主要有DYY-Ⅲ型電泳儀及配套電泳槽、電源（北京六一儀器廠）、DK-S電熱恒溫水浴鍋（上海棱譜儀器儀表有限公司）、PL2002 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、PHS-3G pH酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）、FYL-YS實(shí)驗(yàn)用冰箱（北京福意電器有限公司）、KR-GZ人工氣候室（河南科瑞科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 材料處理與取樣 每個(gè)番茄品種挑選100粒飽滿種子，經(jīng)1 g/L HgCl2溶液消毒8 min，去離子水反復(fù)沖洗；吸脹7 h后28 ℃催芽72 h，將萌發(fā)一致的種子置于含1/2 Hoagland培養(yǎng)液的培養(yǎng)盆中水培，定苗6株/盆，然后移入晝夜溫度為（26±2）℃/（19±2）℃的人工氣候室內(nèi)，幼苗經(jīng)20 d（可長(zhǎng)出約2或3片真葉）培養(yǎng)，以加入20 % PEG-6000的1/2 Hoagland培養(yǎng)液的幼苗水培為處理組（模擬干旱脅迫處理），同時(shí)設(shè)不加20% PEG-6000的幼苗水培為對(duì)照組，均3次重復(fù)。在培養(yǎng)期間，每12 h相應(yīng)更換1次培養(yǎng)液，以減少試驗(yàn)的濃度誤差。在試驗(yàn)開始時(shí)（0 h）和處理后的24、48、72 h分別對(duì)2組番茄幼苗的葉片取樣分析。

1.2.2 SOD同工酶活性測(cè)定 ①SOD粗提。剪取不同處理各番茄品種幼苗葉片（去葉脈）0.5 g，加入1 mL預(yù)冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8，內(nèi)含1% PVP），冰浴研磨至勻漿，加磷酸鹽緩沖液補(bǔ)充至終體積5 mL，勻漿液于4℃ 10 000 r/min離心15 min，上清液即為SOD粗提液。② SOD活性測(cè)定及脅迫系數(shù)計(jì)算。采用改進(jìn)的NBT光還原法，酶的顯色反應(yīng)體系為：50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液1.50 mL，130 mmol/L 甲硫氨酸溶液0.30 mL，0.75 mmol/L NBT溶液0.30 mL，0.1 mmol/L EDTA-Na2 溶液0.03 mL，去離子水0.25 mL。各取2.65 mL反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入4支透明度好的試管內(nèi)，并編號(hào)，1號(hào)、2號(hào)試管再各加入磷酸鹽緩沖液0.05 mL、20 μmol/L核黃素溶液0.30 mL，分別作為暗環(huán)境對(duì)照（調(diào)零對(duì)照）、光環(huán)境對(duì)照；3號(hào)、4號(hào)試管再各加入酶液0.05 mL、20 μmol/L核黃素溶液0.30 mL，并置于4 000 lx光照度、25 ℃下反應(yīng)20 min，作為樣品測(cè)試管；反應(yīng)結(jié)束后，在560 nm 處測(cè)定吸光度，以每克樣品（鮮重）抑制NBT光還原的50%為1個(gè)酶活性單位[8]。采用以下公式計(jì)算SOD活性，酶活單位為U/g（FW），求樣品測(cè)試管酶活性的平均值。

SOD總活性=[（ACK-AE）×V]/（0.5×ACK×W×Vt）；

ACK為光環(huán)境對(duì)照管的吸光度值，AE為樣品管的吸光度值，V為樣品液的總體積，Vt為測(cè)定時(shí)樣品的用量，W為樣品鮮重。

脅迫系數(shù)是植物在發(fā)育過(guò)程中抗脅迫能力高低的一種表述，其計(jì)算公式為：

SOD脅迫系數(shù)=處理組SOD總活性最大值/相應(yīng)對(duì)照組SOD總活性值。

1.2.3 SOD同工酶電泳 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，上樣酶量30 μL，在濃縮膠（濃度為4%）里穩(wěn)流20 mA，進(jìn)入分離膠（濃度為8%）后穩(wěn)流40 mA，6～7 h完成電泳。同工酶電泳染色采用NBT染色法，凝膠依次經(jīng)染液Ⅰ（0.2% NBT溶液）在黑暗下染色20 min、染液Ⅱ（0.001%核黃素溶液+0.33% TEMED溶液+36 mmol/L、pH 7.8 磷酸鹽緩沖液）在黑暗下染色15 min、染液Ⅲ（0.003% EDTA-Na2溶液+50 mmol/L、pH 7.8 磷酸鹽緩沖液）在光照下染色20～30 min，轉(zhuǎn)換染液期間需用去離子水沖洗凝膠，最終用95%乙醇浸泡5 min，再轉(zhuǎn)入去離子水中照相，可使SOD酶帶呈現(xiàn)出清晰透亮的酶譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG脅迫對(duì)番茄幼苗葉片SOD同工酶活性的影響

在20% PEG-6000模擬干旱脅迫處理72 h內(nèi)，4個(gè)番茄品種幼苗葉片的SOD同工酶活性動(dòng)態(tài)變化情況見圖1，處理72 h時(shí)的SOD同工酶活性與脅迫系數(shù)比較情況見表1。從圖1可見，各品種在處理24、48、72 h的SOD同工酶活性均明顯高于對(duì)照組，不過(guò)Money maker的SOD同工酶活性于48 h達(dá)到峰值后因持續(xù)脅迫出現(xiàn)了下降，其他3個(gè)品種于72 h達(dá)到峰值并呈有差異的上升趨勢(shì)，說(shuō)明在一定干旱程度下，番茄可以通過(guò)提高SOD同工酶活性來(lái)適應(yīng)干旱逆境，且品種間適應(yīng)持續(xù)干旱的能力存在差異。由表1可知，番茄品種的脅迫系數(shù)高低順序依次為中蔬4號(hào)、中雜105、Money maker、中雜9號(hào)，說(shuō)明品種間SOD同工酶活性響應(yīng)干旱脅迫的程度明顯不同，其中中蔬4號(hào)響應(yīng)積極，具有相對(duì)較強(qiáng)的清除活性氧和修復(fù)損傷、適應(yīng)脅迫環(huán)境的能力。

2.2 PEG脅迫對(duì)番茄幼苗葉片SOD同工酶酶譜的影響

采用20% PEG-6000模擬干旱脅迫處理24、48、72 h后，獲得的4個(gè)番茄品種幼苗葉片SOD同工酶酶譜見圖2。根據(jù)酶帶電泳遷移率的大小，可將酶譜分為SOD-Ⅰ、SOD-Ⅱ、SOD-Ⅲ 3個(gè)條帶。與對(duì)照組相比，各品種處理組的酶譜條帶仍為3條，沒有新增酶帶，其中SOD-Ⅰ條帶酶譜亮度、帶寬在處理與對(duì)照之間無(wú)明顯差異；SOD-Ⅱ條帶僅中雜105、中蔬4號(hào)的處理48、72 h的明顯增加；4個(gè)品種SOD-Ⅲ條帶均明顯增加，增加程度大小的排序依次為中蔬4號(hào)、中雜105、Money maker、中雜9號(hào)。分析表明，SOD同工酶條帶對(duì)干旱脅迫響應(yīng)敏感程度的大小排序依次為SOD-Ⅲ、SOD-Ⅱ、SOD-Ⅰ，各品種間SOD-Ⅲ條帶的酶譜亮度、帶寬增幅與脅迫系數(shù)一致，因此SOD-Ⅲ條帶的表現(xiàn)可以作為番茄抗旱生理育種的篩選指標(biāo)參考。

3 討論

在正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)的活性氧產(chǎn)生與清除機(jī)制保持著一定的動(dòng)態(tài)平衡，但在干旱脅迫下這種平衡將被打破，造成活性氧大量積累，即氧化迸發(fā)；而與清除機(jī)制有關(guān)的SOD、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）和過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）等保護(hù)酶就會(huì)協(xié)同防御活性氧對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞，以減輕干旱脅迫對(duì)植物的傷害，重新建立動(dòng)態(tài)平衡[9]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PEG模擬干旱處理后，番茄幼苗葉片的SOD同工酶活性明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)了SOD具備抗氧化的生理功能。SOD是生物機(jī)體內(nèi)天然的自由基清除劑，可催化·O2-發(fā)生歧化反應(yīng)而產(chǎn)生H2O2和O2，從而清除活性氧，緩解干旱脅迫造成的膜系統(tǒng)損壞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)番茄品種間適應(yīng)持續(xù)干旱的能力存在差異，且脅迫系數(shù)不同，這與經(jīng)PEG處理的小麥（Triticum aestivum L.）[6]、小黑麥（Triticum×Secale cereale）[10]、新疆野蘋果[Malus sieversii（Ledeb.）Roem.]及平邑甜茶[M. hupehensis（Pamp.）Rehd. var. pingyiensis Jiang][11]等的研究結(jié)論相似。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在PEG模擬干旱脅迫下，4個(gè)番茄品種的SOD同工酶酶譜條帶數(shù)都沒有增加，仍為3條，對(duì)干旱脅迫響應(yīng)敏感程度的大小排序依次為SOD-Ⅲ、SOD-Ⅱ、SOD-Ⅰ，品種間SOD-Ⅲ的酶譜亮度、帶寬增幅與脅迫系數(shù)一致，這說(shuō)明SOD與干旱脅迫密切相關(guān)的同工酶為SOD-Ⅲ，其可能是番茄耐旱品種SOD同工酶活性較高的根源；因此SOD-Ⅲ酶帶可以作為番茄抗旱生理育種的篩選指標(biāo)。然而這與翁明陽(yáng)[6]的研究結(jié)果不盡相同，他認(rèn)為經(jīng)PEG脅迫的小麥幼苗有2條SOD同工酶帶表達(dá)明顯，特異位點(diǎn)POD和CAT同工酶條帶的表現(xiàn)才可作為鑒定小麥抗旱性強(qiáng)弱的指標(biāo)；出現(xiàn)這樣的差異可能是試驗(yàn)所用材料的不同產(chǎn)生的。本研究SOD同工酶酶譜變化較客觀地揭示出了番茄的抗旱機(jī)理，將為進(jìn)一步選育番茄抗旱新品種提供參考依據(jù)。但是，抗旱機(jī)理研究是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，PEG脅迫對(duì)番茄葉片其他保護(hù)酶（POD、CAT等）的影響尚需進(jìn)一步探討。

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