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        小菜蛾p38MAPK基因的克隆與生物信息學(xué)分析

        2013-04-29 00:51:08胡霞谷希樹劉曉琳等
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013年8期
        關(guān)鍵詞:生物信息學(xué)分析絲氨酸小菜蛾

        胡霞 谷希樹 劉曉琳等

        摘要:小菜蛾(Plutella xylostella L)是一種危害十字花科植物的世界性害蟲,研究其基因功能為尋找新的小菜蛾防治方法具有重要意義。本研究克隆了小菜蛾p38 MAPK基因的開放閱讀框(ORF),并根據(jù)其DNA序列推導(dǎo)出了蛋白一級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個含有349個氨基酸殘基的蛋白。通過SMART網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在第20~304位氨基酸殘基區(qū)域存在著一個典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域,說明它是一個潛在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Blast比對發(fā)現(xiàn)Pxp38基因與家蠶Bmp38基因、釀酒酵母ScHOG1基因、人類Homo sapiens p38 基因在蛋白一級結(jié)構(gòu)上的相似性分別是917%、516%和786%,說明p38 MAPK基因在進(jìn)化上具有較高的保守性。

        關(guān)鍵詞:小菜蛾;p38基因;MAPK;絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶;生物信息學(xué)分析

        中圖分類號:Q785:Q969.42+5.2 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2013)08-0015-04

        小菜蛾(Plutella xylostella L)屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae),其分布范圍廣,繁殖能力強(qiáng),主要取食十字花科植物,嚴(yán)重危害蔬菜生產(chǎn)[1,2]。由于小菜蛾的抗藥性發(fā)展十分迅速,因此,尋找新的防治方法已經(jīng)變得十分迫切[3,4]。為了更好地實(shí)現(xiàn)小菜蛾的防治,需要更多地了解小菜蛾的基因尤其是耐藥基因及響應(yīng)外界刺激相關(guān)基因的生物學(xué)功能[5~7]。2012年福建農(nóng)林大學(xué)的尤民生教授等[7]領(lǐng)導(dǎo)的國際合作小組第一次完成了小菜蛾的全基因組序列圖譜的繪制,這為小菜蛾基因功能的研究以及發(fā)展新的防治手段揭開了新的篇章,具有重要意義。本研究就是在小菜蛾全基因組測序的基礎(chǔ)上完成的。

        蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能經(jīng)常需要磷酸化和去磷酸化修飾,細(xì)胞中具有磷酸化修飾功能的酶是蛋白激酶[8]。MAPK(Mitogen-activated protein kinase)是一類典型的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶,在真菌、植物和動物等各種真核生物細(xì)胞內(nèi)保守存在。它可以通過三層蛋白激酶級聯(lián)系統(tǒng),響應(yīng)外界環(huán)境各種脅迫刺激,起始細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)途徑,具有重要的生物學(xué)功能[9,10]。人類細(xì)胞中的MAPK包括p38、Erk1、Erk2和JNK等[11,12]。

        本研究克隆了小菜蛾的Pxp38基因,根據(jù)其基因序列推導(dǎo)出蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu),分析預(yù)測了該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,并研究了該基因與家蠶Bmp38基因、釀酒酵母ScHOG1基因、人類Homo sapiens p38 基因之間的同源性,為下一步深入研究Pxp38基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

        1材料與方法11供試?yán)ハx

        本實(shí)驗(yàn)所用小菜蛾為天津市植物保護(hù)研究所室內(nèi)飼養(yǎng)的敏感種群,用無蟲甘藍(lán)苗繼代飼養(yǎng)20代以上,取四齡幼蟲供試。

        1.2主要試劑

        Trizol和SuperScript cDNA合成試劑盒購自Invitrogen公司;Taq酶、dNTPs、pMD18-T載體和Ecoli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ購自NEB公司;DNA純化回收試劑盒、瓊脂糖、蛋白胨、氨芐青霉素、X-gal、IPTG、DEPC和質(zhì)粒小提試劑盒等購自北京天根生化科技公司。

        1.3引物設(shè)計

        根據(jù)小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫DBM-DB(Diamondback moth Genome Database)[7]提供的Px015291基因序列,在其開放閱讀框(ORF)兩側(cè)各設(shè)計一條引物,由Invitrogen公司合成。上游引物Pxp38-F:5′-ATGCCGAGGTATCACAAAGTGG-3′,下游引物Pxp38-R:5′-CTACCTATAGTTCGGGGTCG-3′。

        1.4小菜蛾總RNA的提取、cDNA第一鏈合成和PCR條件

        取小菜蛾幼蟲100 mg,液氮冷凍研磨后,用Trizol法提取小菜蛾總RNA,具體步驟參照Invitrogen公司的Trizol試劑說明書,最后溶解于 30 μl DEPC水中,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性,將其直接用于RT-PCR或-80℃保存。

        取1 μg總RNA,參照Invitrogen公司的SuperScript cDNA合成試劑盒說明書,以O(shè)ligo(dT)18作為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組,實(shí)驗(yàn)組加逆轉(zhuǎn)錄酶,對照組不加逆轉(zhuǎn)錄酶。

        以實(shí)驗(yàn)組和對照組逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,使用引物Pxp38-F和Pxp38-R進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為:94℃ 5 min; 94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 1 min,30 個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

        1.5重組質(zhì)粒pMD18T-Pxp38 ORF的構(gòu)建與鑒定

        將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收,取100 ng與25 ng pMD18-T載體16℃下連接4 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在LB+Amp平板上通過藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化子,挑取3個白斑轉(zhuǎn)化子接種到液體LB+Amp培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒,利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ對其進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

        1.6生物信息學(xué)分析

        利用Chromas軟件分析DNA測序結(jié)果;通過Vector NTI軟件根據(jù)p38 ORF序列推導(dǎo)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu);通過SMART網(wǎng)站(http://smartembl-heidelbergde/)分析預(yù)測小菜蛾P(guān)xp38蛋白結(jié)構(gòu)域;利用Blast軟件比較不同物種間p38蛋白一級結(jié)構(gòu)的同源性;小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫DBM-DB的網(wǎng)址是http://wwwiaefafueducn/dbm/。

        2結(jié)果與分析

        2.1Pxp38基因ORF的獲得

        利用引物Pxp38-F和Pxp38-R克隆Pxp38基因的ORF片段,結(jié)果如圖1所示,實(shí)驗(yàn)組得到了大小約1 kb的單一DNA條帶,對照組只得到了非特異性雜帶,說明成功獲得了Pxp38基因的ORF片段。

        3討論 本研究首次克隆了小菜蛾的Pxp38 MAPK基因,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,揭示出Pxp38基因是一個潛在的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶,從最簡單的真核模式生物釀酒酵母到高等哺乳動物人類的細(xì)胞中都保守存在。本研究為進(jìn)一步深入探討Pxp38 MAPK基因的功能,揭示小菜蛾響應(yīng)外界脅迫以及產(chǎn)生藥物耐受的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ),為開辟小菜蛾防治新途徑提供參考。

        參考文獻(xiàn):

        [1]Talekar N S, Shelton A M Biology, ecology, and management of the diamondback moth [J] Annu Rev Entomol , 1993, 38: 275-301

        [2]Furlong M J, Wright D J, Dosdall L M Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects [J] Annu Rev Entomol , 2013, 58: 517-541

        [3]Tabashnik B E, Huang F, Ghimire M N, et al Efficacy of genetically modified Bt toxins against insects with different genetic mechanisms of resistance [J] Nat Biotechnol, 2011,29(12):1128-1131

        [4]Baxter S W, Badenes-Pérez F R, Morrison A, et al Parallel evolution of Bacillus thuringiensis toxin resistance in lepidoptera [J] Genomics, 2011, 189(2): 675-679

        [5]He W, You M, Vasseur L, et al Developmental and insecticide-resistant insights from the de novo assembled transcriptome of the diamondback moth, Plutella xylostella [J] Genomics, 2012, 99(3): 169-177

        [6]Li X, Schuler M A, Berenbaum M R Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics[J] Annu Rev Entomol , 2007, 52: 231-253

        [7]You M, Yue Z, He W, et al A heterozygous moth genome provides insights into herbivory and detoxification [J] Nat Genet , 2013, 45(2): 220-225

        [8]Manning G, Whyte D B, Martinez R, et al The protein kinase complement of the human genome [J] Science, 2002, 298(5600): 1912-1934

        [9]Gustin M C, Albertyn J, Alexander M, et al MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae [J] Microbiol Mol Biol Rev , 1998, 62(4): 1264-1300

        [10]Rodriguez M C, Petersen M, Mundy J Mitogen-activated protein kinase signaling in plants [J] Annu Rev Plant Biol , 2010, 61: 621-649

        [11]Pearson G, Robinson F, Beers Gibson T, et al Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions [J] Endocr Rev , 2001, 22 (2): 153-183

        [12]Theodosiou A, Ashworth A MAP kinase phosphatases [J] Genome Biol , 2002, 3(7): REVIEWS3009

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