郭康姣

摘 要： LN04是一株分離自鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)排污口附近的芽孢桿菌（Bacillus sp.），其發(fā)酵上清液與淡水養(yǎng)殖主要病原菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，結(jié)果表明，LN04對(duì)嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiella tarda）、星狀諾卡氏菌（Nocardia asteroides）和鰻弧菌 （Vibrio anguillarum）有很強(qiáng)的抑制作用。LN04的無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀，沉淀物透析除鹽后所得的活性物質(zhì)粗提物初步鑒定為一種抗菌蛋白質(zhì)，該抗菌蛋白可耐受100 ℃的高溫，對(duì)酸的耐受性也比較強(qiáng)，但對(duì)部分蛋白酶敏感。LN04對(duì)部分淡水養(yǎng)殖病原菌的強(qiáng)抑菌作用和它的抗菌蛋白對(duì)環(huán)境條件的高穩(wěn)定性，表明該菌有可能作為一種生防細(xì)菌，開(kāi)發(fā)應(yīng)用于淡水養(yǎng)殖中細(xì)菌病害的防治。

關(guān)鍵詞：生防細(xì)菌；抑菌譜；抗菌蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.004

細(xì)菌病是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)病害，慢性或急性發(fā)作都會(huì)造成養(yǎng)殖生產(chǎn)的重大損失[1]。目前施用抗生素是細(xì)菌病防治的主要手段，但應(yīng)用抗生素防治細(xì)菌病往往引發(fā)諸多嚴(yán)重問(wèn)題，包括細(xì)菌耐藥性、藥殘及對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境和流域因抗生素本底殘留而造成的污染等[2]。國(guó)內(nèi)外諸多研究和生產(chǎn)實(shí)踐表明，針對(duì)性地篩選病原菌的拮抗菌，通過(guò)以菌治菌，可有效尋找到解決細(xì)菌性疾病的新途徑[3-7]。本研究從鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)排污口附近分離到一些水產(chǎn)常見(jiàn)致病菌的拮抗菌，其中菌株LN04對(duì)嗜水氣單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌、星狀諾卡氏菌和鰻弧菌有很強(qiáng)的抑制作用，筆者開(kāi)展了該菌株的抗菌譜檢測(cè)試驗(yàn)并對(duì)其抗菌蛋白的部分特性進(jìn)行了分析，以期為該生防菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

用于分離目標(biāo)菌株的樣品采自福建福清市某一鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)，該養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)常發(fā)生嚴(yán)重的鰻鱺細(xì)菌性病害。

1.2 拮抗菌的分離和富集

1.2.1 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g， 瓊脂20 g，NaCl 10 g，水1 000 mL。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，甘油10 mL，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 mL。

1.2.2 拮抗菌的分離、富集 先以梯度稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行若干梯度的稀釋?zhuān)缓蟛捎猛坎计桨宸ㄔ谘b有分離培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行各梯度稀釋液的涂布，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，挑取單菌落至裝有上述富集培養(yǎng)基的試管，置于臺(tái)式搖床中進(jìn)行發(fā)酵（37 ℃，180 r·mim-1 ），32 h后下?lián)u床，通過(guò)離心或?yàn)V膜過(guò)濾的方法進(jìn)行除菌，獲得上清液，然后檢測(cè)上清液是否有抑菌活性。

1.2.3 抑菌活性檢測(cè) 抑菌活性的檢測(cè)方法按照參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，指示菌為鰻弧菌 （Vibrio anguillarum），該菌來(lái)自于國(guó)家海洋局第三海洋研究所微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2.4 拮抗菌的初步鑒定 應(yīng)用菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)以及菌株的16S rDNA測(cè)序比對(duì)，進(jìn)行拮抗菌的初步鑒定，其中16S rDNA測(cè)序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 菌種發(fā)酵和抑菌譜檢測(cè)

1.3.1 菌種發(fā)酵 把篩選到的拮抗菌接種至裝有KB液體培養(yǎng)基的三角瓶中（接種量5%）進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（37 ℃，200 r·min-1），發(fā)酵持續(xù)48 h，然后發(fā)酵液離心（8 000 r·mim-1， 10 min， 4 ℃）去菌體，所得上清液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑菌譜測(cè)定 選擇鰻鱺養(yǎng)殖主要常見(jiàn)致病菌，包括嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiella tarda）、星狀諾卡氏菌（Nocardia asteroides）、鰻弧菌 （Vibrio anguillarum）、熒光假單胞菌 （Pseudomonas fluorescens）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）等作為抗菌譜檢測(cè)菌（這些檢測(cè)菌除鰻弧菌外均來(lái)自于福建師范大學(xué)教育部工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），按1.2.3方法，進(jìn)行目標(biāo)菌發(fā)酵上清液對(duì)這些病原菌的抑菌作用檢測(cè)，得出所選目標(biāo)菌（拮抗菌）的抑菌譜。

1.4 抗菌物質(zhì)類(lèi)型的初步鑒定

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，把發(fā)酵液除菌后所得上清液用飽和度為70%的硫酸銨溶液沉淀，離心（10 000 r·mim-1， 10 min， 4 ℃）后得沉淀物和離心液，對(duì)沉淀物進(jìn)行透析除鹽，并進(jìn)行濃縮，得到抗菌物質(zhì)（即抗菌蛋白）粗提物，用無(wú)菌水復(fù)溶粗提物，以KB培養(yǎng)基為對(duì)照，用1.2.3的方法分別檢測(cè)該粗提物、離心液及上清液的抑菌活性并進(jìn)行比較。

1.5 抗菌蛋白部分特性分析

抗菌蛋白的特性分析參考文獻(xiàn)[9]的試驗(yàn)方案進(jìn)行，主要考察抗菌蛋白粗提物在不同溫度、酸堿度及蛋白酶作用下，其抑菌活性所受影響和變化。

1.5.1 不同溫度對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響 抗菌蛋白粗提物分別在50，70，90，100 ℃下處理30 min，另外以巴斯德蒸汽加壓消毒方式（121 ℃）處理20 min， 待溫度恢復(fù)至常溫后，對(duì)處理過(guò)的抗菌蛋白粗提物進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，并與處理前（作為對(duì)照組）進(jìn)行對(duì)比。

1.5.2 不同pH 值對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響 依次用pH值為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0的酸堿梯度在恒溫37 ℃下處理抗菌物質(zhì)30 min，而后再用弱酸弱堿把處理液調(diào)回原值，而后進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，并與處理前（作為對(duì)照組）進(jìn)行對(duì)比。

1.5.3 不同蛋白酶對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響 選擇4種常見(jiàn)蛋白酶包括胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶以及胰蛋白酶分別與抗菌蛋白粗提物進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)定為：酶濃度1 mg·mL-1，反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間60 min。酶解反應(yīng)完成之后，水浴加熱（100 ℃，15 min）使酶失活，然后進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，并與處理前（作為對(duì)照組）進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果及目標(biāo)菌的初步鑒定

從樣品中共篩選到對(duì)鰻弧菌有抑菌作用的候選菌11株，編號(hào)LN01～LN11，其中LN04抑菌作用最強(qiáng)。形態(tài)學(xué)的觀察顯示， LN04的菌落呈乳白色，表面有褶皺、細(xì)胞呈桿狀，菌內(nèi)有橢圓形芽孢。菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果為：G+，好養(yǎng)性生長(zhǎng)，而葡萄糖發(fā)酵、檸檬酸鹽發(fā)酵、淀粉水解、明膠液化、V-P測(cè)定等反應(yīng)皆呈陽(yáng)性，據(jù)此并參照伯杰[10]和東秀珠[11]的相關(guān)細(xì)菌鑒定方法， 以及比對(duì)所測(cè)得的16s rDNA 序列，初步鑒定所篩選、獲得的LN04為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

2.2 LN04的抑菌譜

在實(shí)驗(yàn)室條件下，基于抑菌譜測(cè)定的LN04拮抗試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明，LN04對(duì)嗜水氣單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌、星狀諾卡氏菌和鰻弧菌 均有很強(qiáng)的抑制作用，其中對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好。

2.3 抗菌物質(zhì)類(lèi)型的初步鑒定結(jié)果

利用離心、鹽析、透析對(duì)LN04發(fā)酵液進(jìn)行處理，得到了粗提物，以KB培養(yǎng)基為對(duì)照， 按1.2.3的方法，在同一個(gè)抑菌板上進(jìn)行離心液、發(fā)酵上清液、粗提物和對(duì)照組（從左到右依次排列）抑菌活性檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果如圖1。顯然，活性物質(zhì)為胞外分泌物，并且大部分集中在粗提物中，因?yàn)榇痔嵛锏囊志γ黠@大于上清液的抑菌圈。由于硫酸銨對(duì)蛋白質(zhì)具有選擇性沉淀性質(zhì)，因此，LN04發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的胞外抑菌活性物質(zhì)可初步鑒定屬于蛋白類(lèi)。

2.4 溫度對(duì)抗菌蛋白粗提物抑菌活性的影響

抗菌蛋白粗提物經(jīng)各溫度梯度處理一定時(shí)間后，按1.2.3的方法進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)如下表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，LN04的抗菌蛋白對(duì)熱穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過(guò)100 ℃時(shí)，其抑菌活性?xún)H降低15%。

2.5 pH 值對(duì)抗菌蛋白粗提物抑菌活性的影響

按設(shè)定的溫度梯度和時(shí)間對(duì)抗菌蛋白粗提物進(jìn)行處理，然后按1.2.3的方法進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。LN04的抗菌蛋白粗提物對(duì)酸堿度的適應(yīng)范圍較寬，在pH值范圍為4～10時(shí)，抑菌活性影響不是很大，但強(qiáng)酸和強(qiáng)堿對(duì)抑菌活性的破壞相當(dāng)明顯。

2.6 蛋白酶對(duì)抗菌蛋白粗提物抑菌活性的影響

所選擇的4種蛋白酶分別與抗菌蛋白粗提物酶解反應(yīng)后，馬上進(jìn)行失活，然后按1.2.3的方法進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢园l(fā)現(xiàn)，LN04的抗菌蛋白對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，但對(duì)蛋白酶K和木瓜蛋白酶則具有較好的穩(wěn)定性。

3 討 論

鰻鱺養(yǎng)殖通常采用集約化模式，如室外水泥池高密度養(yǎng)殖、室內(nèi)玻璃纖維桶超高密度循環(huán)水養(yǎng)殖等。由于擁擠效應(yīng)和管理疏漏等原因，各種病害經(jīng)常發(fā)生，特別是細(xì)菌性病害如出血病、闌尾病、脫粘癥、腸炎等[12]?；谒a(chǎn)品安全考慮，抗生素用于水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性病害防治已受到越來(lái)越多的限制，人們開(kāi)始探索生防細(xì)菌用于細(xì)菌病防治的可行性并取得良好的效果。芽孢桿菌是一類(lèi)重要的生防細(xì)菌，其篩選及開(kāi)發(fā)利用受到國(guó)內(nèi)外的極大重視，并已在生產(chǎn)上得到成功的應(yīng)用[13-14]。在本研究中，LN04篩選自鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)的排污口，由于排污口特殊的生境，在長(zhǎng)期的作用下，LN04具有了拮抗所在環(huán)境中某些病原菌的特殊功能， 表現(xiàn)為L(zhǎng)N04在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)嗜水氣單胞菌具有強(qiáng)抑制作用，對(duì)遲緩愛(ài)德華菌、星狀諾卡氏菌和鰻弧菌也有很強(qiáng)的拮抗性能。

生防細(xì)菌的拮抗性能，有來(lái)自活菌本身的，也有來(lái)自其分泌的拮抗物質(zhì)如（抗菌蛋白），或兩者兼之。所分泌的活性物質(zhì)，有的分泌于胞內(nèi)，有的分泌于胞外。作為抗菌物質(zhì)，其應(yīng)用價(jià)值除了與其活性和抑菌范圍（抑菌譜）有關(guān)外，還與抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性有重要關(guān)系[15-16]。本研究結(jié)果顯示，LN04所分泌的胞外抗菌蛋白對(duì)環(huán)境條件的穩(wěn)定性良好，其中對(duì)高溫表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，對(duì)酸堿度的適應(yīng)范圍也較廣，對(duì)蛋白酶K和木瓜蛋白酶也不是很敏感，LN04的這些良好性能，包括較好的抑菌活性、較廣的抑菌譜、以及抗菌蛋白對(duì)環(huán)境條件較好的穩(wěn)定性，預(yù)示著該生防菌株有較好的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景。

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