潘冬瑞　李嘯　張瑤　李知洪　俞學(xué)鋒

摘 要：主要研究Zn2+對(duì)基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的影響。以鹵醇脫鹵酶活力為響應(yīng)值，通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出顯著影響因子Zn2+，并確定其最優(yōu)濃度為0.000 7 g·L-1；在50 L罐中進(jìn)行分批發(fā)酵試驗(yàn)，比較分析鹵醇脫鹵酶活力、OD600以及在線(xiàn)參數(shù)OUR、CER等的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)Zn2+可顯著促進(jìn)重組大腸桿菌生長(zhǎng)，提高生長(zhǎng)速率，酶活提高了5.4%。

關(guān)鍵詞：鹵醇脫鹵酶；鋅離子；大腸桿菌；發(fā)酵調(diào)控

中圖分類(lèi)號(hào)：R378.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.002

鹵醇脫鹵酶也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶，通過(guò)分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化鄰鹵醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和鹵化氫，是微生物降解此類(lèi)化合物的關(guān)鍵酶之一，在治理環(huán)境污染方面具有十分重要作用。此外，在催化環(huán)氧化物和鄰鹵醇之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，鹵醇脫鹵酶具有很高的立體選擇性，因而在手性藥物合成方面也有廣闊的應(yīng)用前景。序列同源性搜索以及二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，鹵醇脫鹵酶的結(jié)構(gòu)相似于短鏈脫氫酶/還原酶家族（SDRs），它的3個(gè)重要的催化殘基分別是：L-Tyr145、L-Ser132和L-Arg149[1-2]。鹵醇脫鹵酶是目前世界范圍內(nèi)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，目前的研究均僅限于鹵醇脫鹵酶基因的改造和優(yōu)化，對(duì)于大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的影響因素及過(guò)程調(diào)控的研究甚少。

微生物在生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶過(guò)程中，需要無(wú)機(jī)鹽維持細(xì)胞的滲透壓，并合成核酸等生命物質(zhì)；某些微量元素如錳、鋅、鐵等對(duì)其生理活性物質(zhì)（酶的活性中心或輔酶）的組成，或生理活性作用調(diào)節(jié)物（酶的激活劑）的作用有重要影響[3]。

關(guān)于Zn2+在生物界中重要性上的認(rèn)識(shí)是個(gè)漫長(zhǎng)的經(jīng)歷[4]，包括農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)，最后在近100年來(lái)，發(fā)現(xiàn)在人體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，Zn2+在生理功能上和營(yíng)養(yǎng)作用上具有極為重要的意義，從生命遺傳物質(zhì)核酸到代謝參與物—酶，都有Zn2+的作用，因而研究學(xué)者稱(chēng)其為“生命的火花”。但是，Zn2+在微生物代謝過(guò)程中的作用等相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外成果不多，此方面研究有著十分重要的意義。

筆者主要對(duì)Zn2+在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的過(guò)程進(jìn)行研究，以確定影響菌體生長(zhǎng)及鹵醇脫鹵酶表達(dá)的Zn2+的最優(yōu)百分比，并通過(guò)多參數(shù)相關(guān)分析的方法，探究Zn2+對(duì)鹵醇脫鹵酶生物合成影響的原理，為后續(xù)發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化以及生產(chǎn)放大奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061，由安琪酵母股份有限公司菌種室提供。

1.1.2 試 劑 L-阿拉伯糖L（+）-Arabinose，購(gòu)于Sigma公司。酵母浸出物FM888由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。其它試劑均為分析純AR。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g·L-1）：甘油8，酵母浸出物（FM888）25，NaCl 6.0，KH2PO4 2.5，K2HPO4 2.5，Na2HPO4 5.0，MgSO4·7H2O 1.0，瓊脂粉15。搖瓶液體培養(yǎng)基（g·L-1）：甘油4，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5，微量元素2。50 L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基（g·L-1）：甘油12，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5。

1.1.4 誘導(dǎo)劑溶液 L-阿拉伯糖濃度0.05 g·mL-1。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng) 種子培養(yǎng)：將斜面菌樣接入裝有25 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養(yǎng)20 h。發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)產(chǎn)酶：將種子液接入發(fā)酵搖瓶后，在30 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液OD600達(dá)到2時(shí)，加入0.5 mL·L-1阿拉伯糖溶液，發(fā)酵結(jié)束后收集菌體。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng) 1級(jí)種子培養(yǎng)：將斜面菌樣接入裝有25 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，制備2瓶，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養(yǎng)24 h。2級(jí)種子培養(yǎng)：將2 mL 1級(jí)種子瓶菌樣，接入裝有100 mL液體培養(yǎng)基的1 L的三角瓶中，制備6瓶，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養(yǎng)20 h。發(fā)酵罐分批發(fā)酵培養(yǎng)：滅菌前加入15 mL消泡油，滅菌后將6瓶2級(jí)種子液合并，接入裝有30 L液體培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，在30 ℃、260 r·min-1、0.035 MPa下培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液OD600達(dá)到2時(shí)，加入配制好的L-阿拉伯糖溶液。

1.3 發(fā)酵罐調(diào)控添加策略

pdr2罐未加入Zn2+；pdr3罐配底料時(shí)加入篩選出的最優(yōu)濃度（0.000 7 mol·L-1）的Zn2+。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 測(cè)定項(xiàng)目：pH、OUR、CER、RQ、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧等。發(fā)酵過(guò)程中每1 h測(cè)1次OD600，每2 h測(cè)1次氨基氮和銨根離子，每4 h測(cè)1次鹵醇脫鹵酶酶活和胞內(nèi)胞外Zn2+的含量。

1.4.2 測(cè)定方法 菌體量測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。鹵醇脫鹵酶酶活力測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。鋅離子含量測(cè)定用原子吸收法測(cè)定[7]。氨基氮測(cè)定用甲醛滴定法[8]。用靛酚藍(lán)-分光光度法測(cè)定銨根離子[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶試驗(yàn)

2.1.1 篩選顯著影響因子 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些微量元素對(duì)酶的生理活性物質(zhì)（酶的活性中心或輔酶）的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物（酶的激活劑）的作用有重要影響，基于李建華等[3]對(duì)于影響鹵醇脫鹵酶活力的6種金屬離子：Zn2+ 、Co2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+和Cu2+的考察，選擇其中較顯著的3種影響因子Zn2+、Co2+和Fe2+進(jìn)行深入篩選，在離子濃度0，0.000 2，0.000 4，0.000 6，0.000 8，0.001 0，

0.001 2 g·L-1 7個(gè)濃度下比較，3種金屬離子在不同濃度下的OD600與鹵醇脫鹵酶活力的變化趨勢(shì)如圖1和圖2。

相對(duì)空白組而言，F(xiàn)e2+、Zn2+ 和Co2+對(duì)菌體的生長(zhǎng)都有一定程度的促進(jìn)作用，但Zn2+對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)的促進(jìn)影響更為顯著（見(jiàn)圖1），且在Zn2+ 濃度為0.000 6 g·L-1菌體濃度達(dá)到最大。另外，加Zn2+組對(duì)鹵醇脫鹵酶活力的提高也最為顯著（見(jiàn)圖2），Zn2+ 濃度在0.000 8 g·L-1時(shí)酶活最高。綜上所述，無(wú)論是對(duì)重組大腸桿菌菌體生長(zhǎng)，還是鹵醇脫鹵酶活力的影響上看，最顯著影響因子為Zn2+，因此后續(xù)研究工作圍繞Zn2+展開(kāi)。

2.1.2 顯著因子Zn2+最優(yōu)濃度的確定 為進(jìn)一步找到更準(zhǔn)確的Zn2+最優(yōu)濃度，接下來(lái)的研究將縮小濃度梯度，在離子濃度0，0.000 6，0.000 7，

0.000 8，0.000 9，0.001 0 g·L-1 6個(gè)濃度下比較，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3知，縮小Zn2+濃度梯度后，各試驗(yàn)組中0.000 7 g·L-1濃度下的Zn2+對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)和鹵醇脫鹵酶活力的影響更為顯著，Zn2+最優(yōu)濃度為0.000 7 g·L-1。

2.2 50 L pdr2、pdr3發(fā)酵罐分批發(fā)酵結(jié)果

在50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵試驗(yàn)，添加Zn2+的策略如1.3所示。

兩種控制策略下重組大腸桿菌表達(dá)鹵醇脫鹵酶的發(fā)酵過(guò)程比較如圖4、5和6所示。

由圖4可知，兩罐前2 h的延滯期基本相同，3～7 h pdr3 罐（在底料中加入了最優(yōu)濃度的Zn2+）的生長(zhǎng)速率明顯高于pdr2罐，并在7 h達(dá)到最大菌濃。由圖5知，發(fā)酵前16 h pdr3 罐的鹵醇脫鹵酶酶活相對(duì)于pdr2罐均有一定程度的提高，最大酶活由90 715.60提升至95 590.88，提高了5.4%，而后8 h的酶活兩罐相差不大。pdr3 罐與pdr2 罐比較，其合成最大酶活所需的時(shí)間由16 h縮減至12 h。

由圖6知，兩罐的OUR和CER的趨勢(shì)基本相似，但pdr3罐對(duì)應(yīng)的呼吸強(qiáng)度略大于pdr2罐，代謝更為旺盛；而對(duì)于呼吸熵RQ曲線(xiàn)，pdr3罐的曲線(xiàn)可近似看做是pdr2罐對(duì)應(yīng)的曲線(xiàn)向前平移約3 h所得。

由此推知，Zn2+通過(guò)提高重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生長(zhǎng)速率，同時(shí)提高其生物積累量而提高了鹵醇脫鹵酶的表達(dá)量。

3 結(jié)論與討論

綜合以上搖瓶試驗(yàn)和50 L發(fā)酵試驗(yàn)可知，在底料中加入Zn2+，重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生長(zhǎng)速率得到了明顯提高，菌體的生物積累量增加，鹵醇脫鹵酶的表達(dá)量增加，最大酶活由90 715.60提升至95 590.88，提高了5.4%，且最大酶活表達(dá)時(shí)間提前約4 h。

關(guān)于Zn2+生物學(xué)功能方面的報(bào)道很多。從20世紀(jì)60年代開(kāi)始，如Vallee B L等[10]許多科學(xué)研究已經(jīng)證明：Zn2+是超過(guò)120種酶的重要組成部分，同時(shí)Zn2+也是所有生物正常細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化所不可或缺的。文獻(xiàn)表明，Zn2+對(duì)微生物生長(zhǎng)及代謝的影響可能有以下幾種途徑和方式：（1）DNA聚合酶[11]和RNA聚合酶[12]都是鋅金屬酶[13]，Zn2+可以決定和穩(wěn)定核苷酸的信息[14-15]，從而通過(guò)改變Zn2+的含量即可影響轉(zhuǎn)錄和翻譯。故Zn2+可通過(guò)影響DNA聚合酶和RNA聚合酶的合成，來(lái)影響蛋白質(zhì)的合成和表達(dá)；（2）在糖酵解過(guò)程中，Zn2+是磷酸甘油醛脫氫酶、乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶的活化劑。故Zn2+可參與呼吸作用與多種物質(zhì)代謝過(guò)程；（3）Zn2+和氮代謝有密切的關(guān)系。Zn2+含量的多少可以調(diào)控硝酸還原酶的活性強(qiáng)弱[16]，而硝酸還原酶活性的強(qiáng)弱會(huì)影響到氮素的利用和吸收[17]；（4）鹵醇脫鹵酶有3個(gè)重要的催化殘基分別是：Tyr145、Ser132和Arg149[1-2]，Zn2+可以與絲氨酸關(guān)系密切的色氨酸[12]形成配合物并影響其轉(zhuǎn)化過(guò)程，故Zn2+還可能通過(guò)影響鹵醇脫鹵酶的結(jié)構(gòu)、活性中心等，從而直接影響鹵醇脫鹵酶活力；（5）Zn2+含量的改變使得依賴(lài)Zn2+濃度的細(xì)胞內(nèi)某些金屬離子（比如：錳、鐵、銅）濃度的變化[18]，從而介導(dǎo)細(xì)胞膜發(fā)生改變，影響核酸的結(jié)構(gòu)或核酸代謝中涉及的酶活性[19]。

結(jié)合本課題研究結(jié)果推論得知，Zn2+影響重組大腸桿菌生長(zhǎng)及鹵醇脫鹵酶合成的途徑可能為（1）、（2）和（4）。Zn2+通過(guò)提高重組大腸桿菌E.coli P84A/MC1061的生理活性和生長(zhǎng)速率，同時(shí)提高其生物積累量而提高了鹵醇脫鹵酶的表達(dá)量。不但最大酶活的表達(dá)量提高了，而且最大酶活的表達(dá)時(shí)間提前約4 h，此研究不但為重組大腸桿菌表達(dá)鹵醇脫鹵酶的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)工業(yè)規(guī)模鹵醇脫鹵酶的高效生產(chǎn)具有較大的指導(dǎo)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Johan E T，van Hylckama V， Tang L X， et al.Halohydrin dehalogenases are structurally and mechanistically related to short-chain dehydrogenases/reductases[J].Journal of Bacteriology，2001，183（17）：5058-5066.

[2] Poelarends G J， van Hylckama V， Marchesi J R， et al. Degradation of 1，2-dibromoethane by mycobacterium sp.strain GP1[J].Journal of Bacteriology，1999（181）：2050-2058.

[3] 李建華，李嘯，張婭，等.金屬離子對(duì)鹵醇脫鹵酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響[J].中國(guó)釀造，2012，31（3）：127-131.

[4] 陳貴青.不同油菜品種鋅富集差異及機(jī)理研究[D].重慶：西南大學(xué)，2011.

[5] 李永仙，鄭飛云，李崎，等.重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl誘導(dǎo)表達(dá)β-葡聚糖酶的條件優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，28（2）：250-254.

[6] Fox R J， Davis C S，Mundoref E C， et al. Improving catalytic function by ProSAR-driven enzyme evolution[J].Nat Biotechnol，2007（25）：338-344.

[7] 高淑云.微波消解-火焰原子吸收法測(cè)定生姜中Cu、Mn、Zn、Cd微量元素[J].中國(guó)調(diào)味品，2010（7）：0102-0105.

[8] 卜鳳泉，劉忠英，胡秀麗，等.測(cè)定磷脂中氨基氮的新方法[J].食品科學(xué)，2003（5）：87-91.

[9] 梁劍光，朱玲，徐正軍.靛酚藍(lán)-分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中氨態(tài)氮含量研究[J].分析與檢測(cè)，2006，32（9）：134-137.

[10] Vallee B L， Falchuk K H.Zinc and gene expression[J].Philos Trans R Soc Lond（Series B：Biological Sciences），1981，294（1071）：185-197.

[11] Leiberman I， Abrams R， Hunt N， et al. Levels of enzyme activity and deoxyribonucleic acid synthesis in mammalian cells cultured from the animal[J].J Biol Chem，1963（238）：3955-3962.

[12] Terhune M W， Sandstead H H.Decreased RNA polymerase activity in mammalian zinc deficiency[J].Science，1972（177）：68-69.

[13] Wu F Y H， Wu C W.The role of zinc in DNA and RNA polymerases[M]//Metal Ions in Biological Systems.New York：Dekker，1983：157-192.

[14] Crossley L G， Falchuk K H， Vallee B L.Messenger ribonucleic acid function and protein synthesis in zinc deficient E.gracilis[J].Biochemistry，1982（21）：5359-5363.

[15] 劉巖松，馬培松.鋅銅色氨酸配合物的伏安特性研究[J].山東大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1999，14（3）：344-346.

[16] 常蓬勃，李志云，楊建堂，等.氮鉀鋅配施對(duì)煙草超氧化物歧化酶和硝酸還原酶活性及根系活力的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（1）：266-270.

[17] 方昭希，王明錄，彭代平，等.硝酸還原酶活性與氮素營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系[J].植物生理學(xué)報(bào)，1979，5（2）：123-128.

[18] Kimball S R， Chen S J， Risica R， et al. Effects of zinc deficiency on protein synthesis and expression of specific mRNAs in rat liver[J].Metabolism，1995，44（1）：126-133.

[19] Falchuk K H， Hardy C， Ulpino L， et al. RNA polymerase，manganese，and RNA metabolism of zinc sufficient and deficient E. gracilis[J].Biochem Biophys Res Commun，1977（77）：314-319.