于洪敏　陳景華

[摘要]目的：探討莫諾苷對黑素瘤細胞與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)模型黑素合成的影響。方法：將黑素瘤細胞（A375）與角質(zhì)形成細胞（Hacat）以1：2比例建立共培養(yǎng)模型，以不同濃度莫諾苷進行干預(yù)，通過MTT法測定細胞增殖率；NaOH裂解法測定黑素含量；多巴氧化法測定酪氨酸酶活性。結(jié)果：與陰性對照組相比，10-4 mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫諾苷均對細胞增殖無影響（P>0.05），10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫諾苷均對共培養(yǎng)體系酪氨酸酶活性和黑素合成有極顯著差異（P<0.01）；與陽性對照藥熊果苷組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫諾苷均對共培養(yǎng)體系酪氨酸酶活性和黑素合成有差異（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論： 莫諾苷可能通過抑制酪氨酸酶活性來抑制共培養(yǎng)模型的黑素合成。

[關(guān)鍵詞]莫諾苷；黃褐斑；酪氨酸酶；黑素

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）08-0833-03

黃褐斑是一種獲得性色素沉著性皮膚病，給患者生理和心理都帶來很大影響。人體皮膚顏色各不相同，與種族、年齡、性別、外界環(huán)境以及某些疾病等因素密切相關(guān)，其中黑素細胞產(chǎn)生的黑素是決定皮膚顏色的主要因素[1]，酪氨酸酶是黑素生物合成途徑中的主要限速酶，該酶活性大小決定著黑素形成的數(shù)量。有研究表明，中藥山茱萸的水提取物對黑素合成和黑素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶有抑制作用，提示可能對黃褐斑等色素性疾病具有一定的應(yīng)用開發(fā)前景[2] 。山茱萸是中醫(yī)治療黃褐斑方劑中常被采用的中藥，中醫(yī)認為山茱萸通過補腎的功效來治療黃褐斑[3]。莫諾苷是山茱萸的主要有效成分之一，本實驗研究莫諾苷對共培養(yǎng)模型黑素合成的影響及機制。

1 實驗材料

莫諾苷（購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）；人黑素瘤細胞株（A375）（由中國科學(xué)院細胞中心提供）；人永生化角質(zhì)形成細胞（Hacat）（購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；MEM培養(yǎng)基（購于Gibco公司）；胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清（購于Billab公司）；二甲基亞砜、L-dopa、TritonX-100、熊果苷、甲基噻唑四唑（購于Sigma公司）。酶標儀（上海熱電儀器有限公司）；OLympus倒置顯微鏡（日本Olympus株式會社）；離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；超低溫冰箱（Thermo Electron Corporation）；CO2孵育箱（上海智成分析儀器制造有限公司）。

2 實驗方法

2.1 建立共培養(yǎng)模型：待兩瓶細胞均生長至對數(shù)期時，每個培養(yǎng)瓶中加入1mL25%的胰蛋白酶進行消化，然后分別加入MEM中止消化，1500rpm，離心3min。離心后將細胞重懸。計數(shù)板計數(shù)。按A375細胞數(shù)與Hacat細胞數(shù)比例為1∶2將兩種細胞懸液混合，接種到需要規(guī)格的培養(yǎng)板中。

2.2 細胞增殖率：將 A375 和 Hacat 以1∶2的比例制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為 1.5×104個/mL，接種在 96 孔板中，200μl/孔。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)液，陰性組只加含細胞的培養(yǎng)液，陽性組加入3.67×10-3mol/L熊果苷，實驗組加入莫諾苷各濃度含藥培養(yǎng)液，每孔 200μl，每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在結(jié)束前4 h，每孔加20μl 5g/L MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄原培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150μl，振蕩10min，酶標儀在490nm處測吸光度（A），計算細胞增殖率。細胞增殖率=（A實驗組/A陰性對照組）× 100%。

2.3 黑素含量：本實驗黑素含量測定采用Hunt[4]法。將A375和Hacat以1：2的比例接種到六孔板中，細胞濃度為4.5×104個/ml， 每孔2ml，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h之后棄原培養(yǎng)液，陰性對照組加培養(yǎng)液2ml，陽性對照組3.67×10-3mol/L熊果苷2ml/孔，給藥組設(shè)3個復(fù)孔，每孔2ml，分別加入含不同濃度莫諾苷的培養(yǎng)液。5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。48h以后，棄原培養(yǎng)液，用PH7.4的0.01MPBS洗滌2次，然后加入0.25%胰酶1ml/孔消化大約10min后，加入1mlMEM培養(yǎng)液終止消化，制成細胞懸液，將不同組細胞懸液分別收集到15ml離心管中，1500rpm，離心3min，棄上清，加入100μl濃度為1mol/L NaOH，37℃水浴1h。加400μl雙蒸水釋稀，混勻，每只離心管中取100μl分別加入96孔板中，490nm測定各孔A值。黑素含量=[（A實驗組/細胞數(shù)的平均值）/（A陰性對照組/細胞數(shù)的平均值）]×100%。

2.4 酪氨酸酶活性：細胞內(nèi)酪氨酸酶活性測定[5]采用多巴氧化法。將A375和Hacat以1：2的比例接種到96孔板中，將細胞濃度調(diào)整至1.5×104個/ml， 每孔200μl，5%CO2，37℃培養(yǎng)24h后棄原培養(yǎng)液，陰性對照組只加培養(yǎng)液200μl，陽性對照組加3.67×10-3mol/L熊果苷200μl，給藥組加入含不同濃度莫諾苷的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h， 用pH7.4的0.01M的PBS洗滌2次，每孔加1%Triton-X溶液100μl，迅速置-80℃冰箱30min，然后室溫下融化，充分裂解細胞。37℃預(yù)熱，加0.2%L-dopa溶液50μl/孔，37℃下反應(yīng)3h，490nm波長測定A值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理：使用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，方差齊性用t檢驗，多組間比較采用 LSD 檢驗。

3 結(jié)果

3.1 莫諾苷對共培養(yǎng)模型細胞增殖的影響：結(jié)果見表1，與陰性組相比，10-4mol/L與10-7mol/L之間莫諾苷對共培養(yǎng)模型的抑制率在10%以下，適合進行下一步研究。

3.2 莫諾苷對共培養(yǎng)模型酪氨酸酶活性的影響：結(jié)果見表2，與陰性對照組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L對共培養(yǎng)模型酪氨酸酶活性的抑制作用有顯著差異（P<0.01）。與陽性對照藥熊果苷組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L對共培養(yǎng)模型酪氨酸的抑制作用有差異（P<0.05），抑制作用強于熊果苷。

3.3 莫諾苷對共培養(yǎng)模型黑素合成的影響：結(jié)果見表3，與陰性對照組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L對共培養(yǎng)模型黑素合成的抑制作用有顯著差異（P<0.01）。與陽性對照藥熊果苷組相比，10-5mol/L和10-6mol/L對共培養(yǎng)模型黑素合成的抑制作用有差異（P<0.05），10-7mol/L有顯著差異（P<0.01），抑制作用均強于熊果苷。

4 討論

黃褐斑病程較長，發(fā)展緩慢，以中青年女性多見，嚴重影響美觀，現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)和美容界共同面臨的難題 [6]。黃褐斑的發(fā)病原因，已經(jīng)實驗證明的一點是由于黑色素增多形成的[7]。皮膚色素或黃褐斑與酪氨酸酶有密切關(guān)系。在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸轉(zhuǎn)化為黑色素，從而加重皮膚色斑的形成[8]。黑素生成量與TYR活性相關(guān)，控制其活力即可控制黑素生成量[9]。黑素在表皮基底部的黑素細胞中形成。其過程為黑素細胞中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴、多巴醌最終形成黑素[10]。通過黑素細胞（MC）的體外純培養(yǎng)可以研究黃褐斑、白癜風(fēng)、白發(fā)等色素障礙性疾病的發(fā)病機制，也可以利用黑素細胞模型來篩選治療這些疾病的藥物和方法[11]。黑素細胞與鄰近細胞間的相互作用不容忽視，故黑素細胞和角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)提供了一種更好的檢測模型[12]。實驗表明莫諾苷對A375和Hacat共培養(yǎng)模型酪氨酸酶活性和黑素合成均有抑制作用，對共培養(yǎng)細胞增殖率無明顯影響，表明莫諾苷在不殺細胞濃度范圍內(nèi)通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑素合成，而且抑制作用強于陽性對照藥熊果苷。莫諾苷的研究結(jié)果與預(yù)想一致，這對于開發(fā)治療黃褐斑的藥品或者化妝品有較大的應(yīng)用前景。

[參考文獻]

[1]楊觀招，解士海.龍膽草對人黑素細胞增殖及黑素合成的影響[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2009，9（8）：884-886.

[2]王興焱，王天曄，陳巧云，等.山茱萸水提取物對黑素瘤細胞與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)模型黑素合成的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（12）：141-143.

[3]李紹民，王興焱，張寧，等. 山茱萸提取物對黑素瘤細胞與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)模型中TYR及其相關(guān)蛋白mRNA表達的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（22）：283-286.

[4]Hunt G，Todd C，Cresswell JE.α-Melanocyte stimulating hormone and its analogue NIe4DPhe7α-MSH affect morphology，tyrosinase activity and melanogenesis in cultured human melanocytes[J].J Cell Sci，1994，107：205.

[5]張春香，尹鴻萍，王旻，等.幾種美白活性物質(zhì)對酪氨酸酶活性的體外抑制作用及細胞毒性[J].中國生化藥物雜志，2005，26（2）：72-75.

[6]魏千程，祁元剛， 燕忠生，等.中醫(yī)藥治療黃褐斑的研究進展[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2011，20（10）：1655-1658.

[7]胡軍，孔力，魯春光，等."祛斑霜"治療黃褐斑作用機制的臨床及實驗研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，22（2）：112-113.

[8]潘興昌，葛文津，柳園，等.口服海洋魚皮膠原肽對人體皮膚水份和黃褐斑影響的研究[J].華西醫(yī)學(xué)，2012，27（2）：218-222.

[9]徐文俊，田剛.皮膚黑素代謝研究的新進展[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2008，46（25）：45-48.

[10]杜孝元，劉瑋，史飛，等.酪氨酸酶活性抑制實驗及其在祛斑美白化妝品功效評價中的應(yīng)用[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2005，14（6）：740-742.

[11]唐建，程飚，李勤，等.黑素細胞的體外培養(yǎng)研究進展及意義[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2010，19（8）：1244-1246.

[12]張寧，陳巧云，任燕冬，等.中藥治療黃褐斑實驗研究進展[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2008，17（6）：940-943.

[收稿日期]2013-04-08 [修回日期]2013-04-18

編輯/張惠娟