于洪敏　陳景華

[摘要]目的：探討莫諾苷對(duì)黑素瘤細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)模型黑素合成的影響。方法：將黑素瘤細(xì)胞（A375）與角質(zhì)形成細(xì)胞（Hacat）以1：2比例建立共培養(yǎng)模型，以不同濃度莫諾苷進(jìn)行干預(yù)，通過MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率；NaOH裂解法測(cè)定黑素含量；多巴氧化法測(cè)定酪氨酸酶活性。結(jié)果：與陰性對(duì)照組相比，10-4 mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫諾苷均對(duì)細(xì)胞增殖無影響（P>0.05），10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫諾苷均對(duì)共培養(yǎng)體系酪氨酸酶活性和黑素合成有極顯著差異（P<0.01）；與陽性對(duì)照藥熊果苷組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫諾苷均對(duì)共培養(yǎng)體系酪氨酸酶活性和黑素合成有差異（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論： 莫諾苷可能通過抑制酪氨酸酶活性來抑制共培養(yǎng)模型的黑素合成。

[關(guān)鍵詞]莫諾苷；黃褐斑；酪氨酸酶；黑素

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）08-0833-03

黃褐斑是一種獲得性色素沉著性皮膚病，給患者生理和心理都帶來很大影響。人體皮膚顏色各不相同，與種族、年齡、性別、外界環(huán)境以及某些疾病等因素密切相關(guān)，其中黑素細(xì)胞產(chǎn)生的黑素是決定皮膚顏色的主要因素[1]，酪氨酸酶是黑素生物合成途徑中的主要限速酶，該酶活性大小決定著黑素形成的數(shù)量。有研究表明，中藥山茱萸的水提取物對(duì)黑素合成和黑素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶有抑制作用，提示可能對(duì)黃褐斑等色素性疾病具有一定的應(yīng)用開發(fā)前景[2] 。山茱萸是中醫(yī)治療黃褐斑方劑中常被采用的中藥，中醫(yī)認(rèn)為山茱萸通過補(bǔ)腎的功效來治療黃褐斑[3]。莫諾苷是山茱萸的主要有效成分之一，本實(shí)驗(yàn)研究莫諾苷對(duì)共培養(yǎng)模型黑素合成的影響及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

莫諾苷（購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）；人黑素瘤細(xì)胞株（A375）（由中國科學(xué)院細(xì)胞中心提供）；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（Hacat）（購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；MEM培養(yǎng)基（購于Gibco公司）；胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清（購于Billab公司）；二甲基亞砜、L-dopa、TritonX-100、熊果苷、甲基噻唑四唑（購于Sigma公司）。酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；OLympus倒置顯微鏡（日本Olympus株式會(huì)社）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；生物潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；超低溫冰箱（Thermo Electron Corporation）；CO2孵育箱（上海智成分析儀器制造有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立共培養(yǎng)模型：待兩瓶細(xì)胞均生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入1mL25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，然后分別加入MEM中止消化，1500rpm，離心3min。離心后將細(xì)胞重懸。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。按A375細(xì)胞數(shù)與Hacat細(xì)胞數(shù)比例為1∶2將兩種細(xì)胞懸液混合，接種到需要規(guī)格的培養(yǎng)板中。

2.2 細(xì)胞增殖率：將 A375 和 Hacat 以1∶2的比例制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為 1.5×104個(gè)/mL，接種在 96 孔板中，200μl/孔。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)液，陰性組只加含細(xì)胞的培養(yǎng)液，陽性組加入3.67×10-3mol/L熊果苷，實(shí)驗(yàn)組加入莫諾苷各濃度含藥培養(yǎng)液，每孔 200μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在結(jié)束前4 h，每孔加20μl 5g/L MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄原培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150μl，振蕩10min，酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（A實(shí)驗(yàn)組/A陰性對(duì)照組）× 100%。

2.3 黑素含量：本實(shí)驗(yàn)黑素含量測(cè)定采用Hunt[4]法。將A375和Hacat以1：2的比例接種到六孔板中，細(xì)胞濃度為4.5×104個(gè)/ml， 每孔2ml，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h之后棄原培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組加培養(yǎng)液2ml，陽性對(duì)照組3.67×10-3mol/L熊果苷2ml/孔，給藥組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔2ml，分別加入含不同濃度莫諾苷的培養(yǎng)液。5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。48h以后，棄原培養(yǎng)液，用PH7.4的0.01MPBS洗滌2次，然后加入0.25%胰酶1ml/孔消化大約10min后，加入1mlMEM培養(yǎng)液終止消化，制成細(xì)胞懸液，將不同組細(xì)胞懸液分別收集到15ml離心管中，1500rpm，離心3min，棄上清，加入100μl濃度為1mol/L NaOH，37℃水浴1h。加400μl雙蒸水釋稀，混勻，每只離心管中取100μl分別加入96孔板中，490nm測(cè)定各孔A值。黑素含量=[（A實(shí)驗(yàn)組/細(xì)胞數(shù)的平均值）/（A陰性對(duì)照組/細(xì)胞數(shù)的平均值）]×100%。

2.4 酪氨酸酶活性：細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性測(cè)定[5]采用多巴氧化法。將A375和Hacat以1：2的比例接種到96孔板中，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1.5×104個(gè)/ml， 每孔200μl，5%CO2，37℃培養(yǎng)24h后棄原培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組只加培養(yǎng)液200μl，陽性對(duì)照組加3.67×10-3mol/L熊果苷200μl，給藥組加入含不同濃度莫諾苷的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h， 用pH7.4的0.01M的PBS洗滌2次，每孔加1%Triton-X溶液100μl，迅速置-80℃冰箱30min，然后室溫下融化，充分裂解細(xì)胞。37℃預(yù)熱，加0.2%L-dopa溶液50μl/孔，37℃下反應(yīng)3h，490nm波長(zhǎng)測(cè)定A值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，方差齊性用t檢驗(yàn)，多組間比較采用 LSD 檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 莫諾苷對(duì)共培養(yǎng)模型細(xì)胞增殖的影響：結(jié)果見表1，與陰性組相比，10-4mol/L與10-7mol/L之間莫諾苷對(duì)共培養(yǎng)模型的抑制率在10%以下，適合進(jìn)行下一步研究。

3.2 莫諾苷對(duì)共培養(yǎng)模型酪氨酸酶活性的影響：結(jié)果見表2，與陰性對(duì)照組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L對(duì)共培養(yǎng)模型酪氨酸酶活性的抑制作用有顯著差異（P<0.01）。與陽性對(duì)照藥熊果苷組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L對(duì)共培養(yǎng)模型酪氨酸的抑制作用有差異（P<0.05），抑制作用強(qiáng)于熊果苷。

3.3 莫諾苷對(duì)共培養(yǎng)模型黑素合成的影響：結(jié)果見表3，與陰性對(duì)照組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L對(duì)共培養(yǎng)模型黑素合成的抑制作用有顯著差異（P<0.01）。與陽性對(duì)照藥熊果苷組相比，10-5mol/L和10-6mol/L對(duì)共培養(yǎng)模型黑素合成的抑制作用有差異（P<0.05），10-7mol/L有顯著差異（P<0.01），抑制作用均強(qiáng)于熊果苷。

4 討論

黃褐斑病程較長(zhǎng)，發(fā)展緩慢，以中青年女性多見，嚴(yán)重影響美觀，現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)和美容界共同面臨的難題 [6]。黃褐斑的發(fā)病原因，已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明的一點(diǎn)是由于黑色素增多形成的[7]。皮膚色素或黃褐斑與酪氨酸酶有密切關(guān)系。在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸轉(zhuǎn)化為黑色素，從而加重皮膚色斑的形成[8]。黑素生成量與TYR活性相關(guān)，控制其活力即可控制黑素生成量[9]。黑素在表皮基底部的黑素細(xì)胞中形成。其過程為黑素細(xì)胞中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴、多巴醌最終形成黑素[10]。通過黑素細(xì)胞（MC）的體外純培養(yǎng)可以研究黃褐斑、白癜風(fēng)、白發(fā)等色素障礙性疾病的發(fā)病機(jī)制，也可以利用黑素細(xì)胞模型來篩選治療這些疾病的藥物和方法[11]。黑素細(xì)胞與鄰近細(xì)胞間的相互作用不容忽視，故黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)提供了一種更好的檢測(cè)模型[12]。實(shí)驗(yàn)表明莫諾苷對(duì)A375和Hacat共培養(yǎng)模型酪氨酸酶活性和黑素合成均有抑制作用，對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞增殖率無明顯影響，表明莫諾苷在不殺細(xì)胞濃度范圍內(nèi)通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑素合成，而且抑制作用強(qiáng)于陽性對(duì)照藥熊果苷。莫諾苷的研究結(jié)果與預(yù)想一致，這對(duì)于開發(fā)治療黃褐斑的藥品或者化妝品有較大的應(yīng)用前景。

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[收稿日期]2013-04-08 [修回日期]2013-04-18

編輯/張惠娟