劉丹等

[摘要]目的：脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子（ADSC-bFGF）對大鼠背部帶蒂皮瓣模型存活率的影響。方法：獲得SD大鼠腹股溝脂肪，經(jīng)體外分離、培養(yǎng)并進(jìn)行多功能分化潛能的鑒定。MTT法檢測bFGF培養(yǎng)液對ADSC的影響。建立大鼠背部自身對照帶蒂皮瓣模型。應(yīng)用CM-DiI熒光染料標(biāo)記ADSC。在皮瓣可預(yù)測壞死區(qū)域分別給予A1組bFGF、A2組ADSC、A3組bFGF-ADSC、B組生理鹽水。全部動(dòng)物于術(shù)后7天測量皮瓣成活面積、HE染色、冰凍切片的CD31熒光顯影，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ADSC-bFGF促進(jìn)皮瓣成活的作用。結(jié)果：bFGF有明顯促ADSC增殖作用，增值最快的最低濃度為5μg/L。A3組皮瓣成活率、毛細(xì)血管增生均顯著高于其它組。結(jié)論：bFGF可促ADSC增值，具有協(xié)同作用。ADSC-bFGF可高效的刺激大鼠背部自身對照帶蒂皮瓣的血管新生，顯著的提高皮瓣的成活率。

[關(guān)鍵詞]脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；大鼠背部帶蒂皮瓣

[中圖分類號]R622 R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）08-0829-04

提高皮瓣的成活率，促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是目前臨床工作需要解決的關(guān)鍵問題，因此研究尋求有效的方法預(yù)防術(shù)后皮瓣的缺血壞死具有重要的理論和臨床實(shí)際意義。使用各種不同的動(dòng)物皮瓣模型往往會導(dǎo)致難以解釋的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究采用可預(yù)測皮瓣壞死面積的帶蒂皮瓣模型，并改進(jìn)形成自身對照皮瓣。目的是通過使用ADSC-bFGF局部注射，刺激大鼠實(shí)驗(yàn)組皮瓣模型的血管新生，從而增加皮瓣的成活率。

1 材料

1.1 設(shè)計(jì)：采取隨機(jī)，對照，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料：健康純種雄性SD大鼠，質(zhì)量為400～500g，21只，250～280g，10只。（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Sigma公司），油紅O（美國Sigma公司）；2%茜紅素染液（美國Sigma公司），噻唑藍(lán)（MTT）檢測試劑盒（ 武漢博士德） ，二甲基亞砜（美國Sigma公司），CM-DiI（美國Molecular Probe公司），小鼠抗大鼠CD31抗體美國Abcam公司）；貝復(fù)濟(jì)（珠海億勝生物制藥有限公司）山羊抗小鼠IgG-FITC（中杉金橋）；酶標(biāo)儀（日本Reader儀器公司）

2 方法

2.1 脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞 （Adipose derived stromal cell，ADSC）的體外分離、純化、擴(kuò)增培養(yǎng)：取250～280g雄性SD大鼠，無菌條件下采集雙側(cè)腹股溝脂肪，0.1%Ⅰ型膠原酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM-F12終止，離心重懸，以3×104個(gè)/cm2接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶，置于 37℃，5% C02的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，72h換液，棄掉未貼壁細(xì)胞，每3天換液1次。通過多次傳代獲取純化的ADSC。

2.2 ADSC分化能力的鑒定：向培養(yǎng)ADSC的6孔板加入成骨、成脂誘導(dǎo)液，4周后進(jìn)行茜素紅染色、油紅O染色檢測。

2.3 bFGF對ADSC增值影響：取第5代ADSC接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后每孔按0、2.5、5、10、50、100μg/L濃度加入bFGF培養(yǎng)液200μl，每個(gè)濃度3孔；48h后檢測，加5 g/L的MTT 溶液20μl，37℃孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，再加二甲基亞砜150μl低速震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測A490值，并記錄結(jié)果。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2.4 DiI熒光標(biāo)記ADSC：注射細(xì)胞之前，取第5代細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液制成2×106/ml的細(xì)胞懸液1ml，加2μg/ml DiI染液，37℃孵育30min，離心重懸后，傾去染液，加PBS溶液制成1ml細(xì)胞懸液，孵箱孵育5min后移入4℃冰箱備用。

2.5 實(shí)驗(yàn)分組及治療：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21只，每只分為左側(cè)實(shí)驗(yàn)組A組（隨機(jī)分成A1、2A、A3）、右側(cè)對照組B組。A 1組：注射bFGF；A2組：注射ADSC；A3組：注射ADSC+ bFGF；B組：注射生理鹽水。

2.6 大鼠背部自身對照帶蒂皮瓣模型的建立：健康純種雄性SD大鼠，400～500g，水合氯醛（10%）腹腔注射麻醉（3ml/kg），自身對照皮瓣模型設(shè)計(jì)成兩個(gè)等大矩形，大小3cm×8cm。消毒鋪巾，沿設(shè)計(jì)切口線切開皮膚至深筋膜層，沿頭尾方向掀起皮瓣，離斷全部穿支血管，僅保留兩側(cè)旋髂深動(dòng)脈為蒂，徹底止血。取經(jīng)標(biāo)記的ADSC，對A1、A2、A3、B組分別注射bFGF、ADSC、ADSC-bFGF懸液、生理鹽水，注射范圍是皮瓣頭側(cè)上1/3，每點(diǎn)均為0.1ml，總量為1ml/只，原位縫合切口。術(shù)后7天觀察皮瓣 （圖1）。

2.7 皮瓣壞死的鑒定：術(shù)后7天，處死動(dòng)物，數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照，使用Image pro-Plus6.0軟件評估皮瓣成活與壞死面積。通過公式R=皮瓣存活面積/皮瓣總面積×100%計(jì)算皮瓣成活率。

2.9 組織學(xué)觀察：切取各組成活皮瓣遠(yuǎn)端，制成石蠟病理切片HE染色，鏡下觀察血管增生情況。

2.10 ADSC及CD31在皮瓣中的檢測：切取A組注射細(xì)胞區(qū)域的皮瓣組織，快速制成冰凍切片，用免疫熒光染色法對血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31進(jìn)行檢測，判定微血管密度和皮瓣中細(xì)胞情況。

2.11應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1體外ADSC的培養(yǎng)與鑒定：ADSC原代培養(yǎng)2周，可達(dá)90%融合，平行排列呈漩渦狀，形態(tài)以長梭形為主，可進(jìn)行傳代。取第3代細(xì)胞，經(jīng)成骨誘導(dǎo)4周可見茜素紅染色致密、不透光的鈣化結(jié)節(jié)，呈淡紅色；經(jīng)成脂誘導(dǎo)油紅O染色可見大小不等成圓性橙紅色的脂肪滴；證明誘導(dǎo)成功。

3.2 MTT檢測bFGF對ADSC增值作用：在本研究的劑量范圍內(nèi)，不同濃度bFGF對ADSC的增值均有促進(jìn)作用（P<0.05）。5ng/ml組與2.5mg/ml組組相比，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；5ng/ml組與10ng/ml組、50ng/ml組、100ng/ml組組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。因此， 促進(jìn)ADSC增殖最快的最低濃度是5ng/ml（表1）。

3.4皮瓣大體觀察及成活情況：術(shù)后1周，觀察大鼠背部皮瓣，其成活區(qū)和壞死區(qū)分界明顯，易辨別。圖片經(jīng)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算出 A1、A2、A3、B組皮瓣成活率分別是（86.01±1.71）%、（91.73±2.23）%、（95.12±2.01）%、（70.68±1.82）%。統(tǒng)計(jì)學(xué)各組分析比較，A3組皮瓣存活率明顯高于A1、A2、B組（P<0.01），A1組成活率高于A2組（P<0.01）（表2，圖2）。

3.5 HE 染色分析：HE染色可見，A3比A1、A2組皮瓣的新生毛細(xì)血管分布明顯增多，纖維組織細(xì)胞增生明顯，B組新生血管較少。

3.6 ADSC在皮瓣內(nèi)的分布與檢測：熒光顯微鏡下觀察可見，經(jīng)CM-DiI染色呈陽性的ADSC為紅色熒光、CD31呈陽性為綠色熒光，且紅色熒光的ADSC在綠色熒光的內(nèi)皮細(xì)胞之間，參與構(gòu)成了毛細(xì)血管的管腔結(jié)構(gòu)。（圖3）

4 討論

可預(yù)測皮瓣壞死面積的軸型皮瓣模型[1]，平均成活比例為（70.5±4.8）%，這種可預(yù)測性對研究皮瓣的病理生理學(xué)有重要意義，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上建立自身對照的帶蒂皮瓣，使個(gè)體差異性減小且對比性更強(qiáng)。提高皮瓣的成活率，增加血液循環(huán)及血管再生是關(guān)鍵。

bFGF是一種多功能細(xì)胞生長因子，是血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的高效促生長劑，能夠有效的促進(jìn)新生毛細(xì)血管的形成[2-3]，從而促進(jìn)皮瓣成活。劉斌[4]等證實(shí)應(yīng)用bFGF可促進(jìn)新生微血管的數(shù)量增加，從而增加大鼠背部隨意皮瓣成活面積。本實(shí)驗(yàn)也顯示A1組明顯高于B組的皮瓣成活面積。

2001年，Zuk等[5]成功從脂肪組織中分離培養(yǎng)出ADSC，因其具有與骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞一樣的多項(xiàng)分化潛能，取材方便，損傷小，且來源豐富，又不受倫理學(xué)約束，被認(rèn)為可能會成為組織工程的理想種子細(xì)胞。由于ADSC在體外容易擴(kuò)增，長期表達(dá)穩(wěn)定，并且ADSC移植體內(nèi)在自身存活基礎(chǔ)上，還可很大程度改善機(jī)體功能[6]。因此，在修復(fù)缺血皮瓣和組織工程方面起了重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道ADSC能生成血管結(jié)構(gòu)和抗凋亡因子，有影響血管再形成的潛力，也可分化成有功能的內(nèi)皮細(xì)胞[7-9]。本研究結(jié)果顯示：成紅色熒光的ADSC分布在成綠色熒光的血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍，說明ADSC參與并促進(jìn)了毛細(xì)血管管腔的構(gòu)成。ADSC可以預(yù)防新生小鼠的缺血缺氧性腦病的發(fā)生，可增加兔任意型皮瓣的成活面積[10-11]，其主要原因可能與其具有分化生成內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，增升血管密度，從而增加組織成活的作用有關(guān)。本研究中A2組皮瓣成活率明顯高于B組與A1，也證明了上述觀點(diǎn)，并且分別單獨(dú)使用ADSC比bfGF促皮瓣成活率效果好。

bFGF屬于多肽類細(xì)胞生長因子，對中胚層來源的細(xì)胞具有明顯的促增殖作用[12]。有研究表明，bFGF可以促進(jìn)猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[13-14]。本文使用含不同濃度的bFGF培養(yǎng)液培養(yǎng)ADSC，經(jīng)MTT檢測表明，bFGF促ADSC增值作用顯著，且5ng/ml是作用最快的最低濃度；同時(shí)，ADSC移植能促進(jìn)腦缺血大鼠缺血區(qū)微血管的生成，ADSC-bFGF 能刺激大鼠腹部橫行腹直肌肌皮瓣的血管新生，增加皮瓣的存活率[15-16]。其機(jī)制可能是ADSC可促進(jìn)bFGF的表達(dá)，bFGF又可促ADSC生長，二者相互協(xié)同，從而可顯著的促進(jìn)皮瓣成活面積。

綜上所述，單一因素的bFGF、ADSC都能促進(jìn)皮瓣成活，而且二者之間具有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)使用ADSC-bFGF進(jìn)行皮瓣局部注射，皮瓣成活率顯著高于單一使用bFGF和ADSC懸液組。說明bFGF可提高ADSC增值和皮瓣成活率的同時(shí)，后者也可促進(jìn)前者的生成以及皮瓣成活。因此，多因素之間互相促進(jìn)、生長，把ADSC和bFGF的優(yōu)勢有機(jī)結(jié)合，能更強(qiáng)的促進(jìn)缺血組織的血管新生，增加背部自身對照帶蒂皮瓣的成活面積。為ADSC-bFGF的臨床應(yīng)用研究提供理論與實(shí)踐依據(jù)；特別是對整形外科中的皮膚組織修復(fù)具有重要意義。

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[收稿日期]2013-03-15 [修回日期]2013-04-16

編輯/張惠娟