周亞軍　周俊波等

摘要：采用改良的CTAB法、SDS法和試劑盒法提取檉柳（Tamarix chinensis Lour）和美人蕉（Canna indica Linn）不同組織中的RNA，通過紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳對提取的RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，CTAB法從檉柳和美人蕉葉中提取的RNA A260 nm/A280 nm分別為1.96和1.91，純度較高。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示CTAB法和SDS法提取的植物RNA 28 S rRNA和18 S rRNA條帶清晰明亮，說明提取的RNA完整性好，濃度較高；而試劑盒法提取的植物RNA存在降解現(xiàn)象和雜質(zhì)干擾。

關(guān)鍵詞：RNA；提取方法；檉柳（Tamarix chinensis Lour）；美人蕉（Canna indica Linn）

中圖分類號：Q522；S793.5；S682.2+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2177-04

提取純度高、完整性好的RNA是cDNA文庫構(gòu)建、Northern印跡雜交分析等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)[1-3]。不同植物或同種植物不同組織中所含的化學(xué)成分有很大差別，因此RNA的提取方法也不盡相同[4，5]，實(shí)驗(yàn)時(shí)要求根據(jù)不同植物的特點(diǎn)選擇適宜的RNA提取方法。檉柳（Tamarix chinensis Lour）為檉柳科檉柳屬灌木或小喬木，具有較強(qiáng)的抗鹽、抗旱脅迫，耐沙埋、耐貧瘠、耐高溫等特性[6，7]。美人蕉（Canna indica Linn）為美人蕉科美人蕉屬植物，對重金屬有較好的耐受與富集能力，是優(yōu)良的環(huán)境監(jiān)測與修復(fù)植物。本研究對傳統(tǒng)的CTAB法、SDS法進(jìn)行適當(dāng)改良，并與試劑盒法一起，對檉柳和美人蕉不同組織中的RNA進(jìn)行提取和檢測，對各方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較分析，旨在為這兩種植物RNA的提取提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 植物樣品采集 鮮檉柳莖、葉、子和鮮美人蕉花、葉、莖于2011年8月采自湖州師范學(xué)院校園內(nèi)植物種植基地。

1.1.2 儀器和試劑 主要儀器有UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）、Sigma 3-18K型高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）、DYY-4C型電泳儀（北京六一儀器廠）、WH-966型調(diào)速混合器（太倉市科教器材廠）等。RNA提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；巰基乙醇、Tris-酚、Tris-HCl、氯仿、無水乙醇、LiCl、NaAc、CTAB、SDS等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DEPC購自生工生物工程（上海）有限公司；液氮購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 RNA的提取

RNA提取方法在文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良。

1.2.1 CTAB法 將0.8 mL硼砂-CTAB提取緩沖液加入到2 mL離心管中，加入80 μL β-巰基乙醇；將0.15 g新鮮植物樣品用液氮冷凍研磨后迅速轉(zhuǎn)到溫浴過的離心管中，劇烈振蕩離心管，將組織與提取液充分混勻，65 ℃溫浴6 min后迅速置于冰上；待冷卻后加入提取液1/2體積的Tris-酚及1/2體積的氯仿，渦旋振蕩器劇烈振蕩2 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液重復(fù)抽提一次；向上清液中加入等體積氯仿，振蕩1 min，12 000 r/min離心8 min，取上清液，加入1/2體積無水乙醇、與上清液等體積的4 mol/L LiCl，混勻，冰浴沉淀0.5 h，12 000 r/min離心10 min，移棄上清液，用75%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇洗滌沉淀兩次，離心分離后用SSTE溶液[1.0 mol/L NaCl、0.5% SDS、10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、2.5 mmol/L EDTA]溶解沉淀，加等體積氯仿-異戊醇（體積比為24∶1，下同）抽提一次后，加2 mol/L的NaAc溶液和2倍體積無水乙醇冰浴沉淀0.5 h，12 000 r/min離心10 min，沉淀用無水乙醇洗滌2次，離心分離后沉淀加入適量DEPC水溶解，即獲得RNA的水溶液。

1.3 RNA質(zhì)量檢測

1.3.1 紫外分光光度法 用紫外分光光度法檢測RNA純度。取少量待測RNA樣品，用蒸餾水稀釋50倍，以蒸餾水作空白對照，測定其在260 nm和280 nm波長處的吸光度，并計(jì)算A260 nm/A280 nm；純RNA樣品的A260 nm/A280 nm約為2.0，低于2.0可能有蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳 另取2 μL RNA提取樣品，用0.8%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測（90 V、20 min），在紫外燈下觀察并拍照，電腦保存樣片。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度法檢測結(jié)果

紫外分光光度法檢測結(jié)果見表1。由表1可知，用CTAB法和SDS法提取檉柳和美人蕉葉中RNA，測得A260 nm/A280 nm介于1.8～2.0之間，說明所獲得的RNA純度較好，蛋白質(zhì)、糖等雜質(zhì)存在較少。3種方法從檉柳莖、子及美人蕉花、莖中提取的RNA A260 nm/A280 nm都低于1.8，說明RNA純度低、雜質(zhì)較多。用試劑盒法從兩種植物不同組織中提取的RNA A260 nm/A280 nm均低于1.6，且RNA降解嚴(yán)重。SDS法與CTAB法相比，相同的植物組織用CTAB法提取的RNA純度總體上高于SDS法，蛋白質(zhì)和糖等雜質(zhì)的污染較小。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

3 小結(jié)與討論

提取植物組織RNA時(shí)常遇到一些問題，如RNA的產(chǎn)量很低或沒有、RNA降解、酚類化合物的干擾、DNA的污染、多糖干擾、蛋白質(zhì)干擾、未知物質(zhì)的干擾（多為植物次級代謝物質(zhì)）等[9-11]，需要根據(jù)不同植物組織的特點(diǎn)采取適宜的提取方法。采用改良的CTAB法、SDS法和試劑盒法提取檉柳及美人蕉組織中的RNA，以CTAB法從兩種植物葉中提取的RNA質(zhì)量最好，完整性好、純度和產(chǎn)率高；其次是SDS法從植物葉中提取的RNA，采用試劑盒法提取的植物RNA純度和產(chǎn)率均較低，存在雜質(zhì)污染和降解現(xiàn)象。

同種植物不同組織由于所含化學(xué)成分的差異，提取RNA的方法也存在不同的難點(diǎn)[12]，RNA的提取效果也有差異。本實(shí)驗(yàn)中檉柳和美人蕉均是葉中的RNA提取比較容易，純度、產(chǎn)量和產(chǎn)率都較高，且植物樣品越鮮嫩提取效果越好。

CTAB法是以CTAB為變性劑，加入β-巰基乙醇使蛋白質(zhì)變性、抑制RNase的活性，使用無水乙醇和LiCl沉淀總核酸和雜蛋白等，然后通過氯仿抽提和無水乙醇沉淀選擇性地分離出RNA。對于富含多糖多酚類物質(zhì)的植物材料，用CTAB作為陽離子表面活性劑成分可分離出高質(zhì)量的RNA已經(jīng)在很多植物中得到驗(yàn)證[9，10]。SDS法從檉柳和美人蕉組織中提取RNA的效果略差于CTAB法，可能是由于SDS法無法有效去除植物組織中的多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，電泳點(diǎn)樣時(shí)存在飄樣現(xiàn)象。試劑盒法雖然比較方便快速，但是在本實(shí)驗(yàn)中提取效果并不好，RNA產(chǎn)量很低且降解嚴(yán)重，相對成本較高，可見它有一定的局限性。

采用LiCl與無水乙醇共同作用沉淀RNA，效果較好，LiCl還可以去除膠質(zhì)和多糖類物質(zhì)，有效防止多糖物質(zhì)對RNA提取和純化的干擾。但用75%的乙醇洗滌2次后還會有Li+和Cl-殘留在RNA的沉淀中，干擾RNA的反轉(zhuǎn)錄和體外翻譯，如果多次用75%的乙醇洗滌又會降低RNA的產(chǎn)率。本研究采用NaAc溶液和無水乙醇冰浴沉淀的方法，使Li+和Cl-溶解于溶液中，有效地減少了Li+和Cl-污染。最后采用SSTE緩沖液溶解沉淀，并再次用無水乙醇冰浴沉淀，起到了較好的純化作用。SSTE緩沖液中的Tris-HCl與NaCl組成緩沖體系，不僅起緩沖作用，還可防止RNA降解，EDTA能螯合金屬離子，抑制RNA酶的活性，也起到防止RNA降解的作用。

增加氯仿抽提次數(shù)能有效去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。采用酸酚不但可以抑制RNase的活性，而且在酸性條件下使蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，而RNA則進(jìn)入水相，達(dá)到純化的目的。洗滌沉淀用75%的乙醇，目的是去除鹽離子的干擾，但由于水分的存在，多次洗滌將影響RNA產(chǎn)率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王浴生.中藥藥理與應(yīng)用[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1983.

[2] 張玉剛，成建紅，韓振海，等.小金海棠總RNA提取方法比較及cDNA的LD-PCR擴(kuò)增[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2005（4）：50-53.

[3] 趙小蘭，蘇曉華，趙梁軍.多花薔薇總RNA提取方法[J]. 中國生物工程雜志，2005，25（9）：89-93.

[4] 史公軍，侯喜林，易金鑫. 白菜花藥組織總RNA提取方法比較及其分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（3）：97-99.

[5] AINSWORTH C. Isolation of RNA from floral tissue of Rumex acetosa（Sorrel）[J]. Plant Molecular Biology Report，1994，12（3）：198-203.

[6] 劉淑紅，楊太新.中國檉柳葉片光合特性日變化的研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（1）：102-104.

[7] 郭曉紅，洪艷華，韓文革，等. 檉柳過氧化物酶基因的序列分析及山新楊遺傳轉(zhuǎn)化研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（3）：615-620.

[8] 王玉成，薄海俠，楊傳平.胡楊、檉柳總RNA提取方法的建立[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，31（5）：99-100.

[9] JONES C S， IANNETTA P P M， WOODHEAD M， et al. The isolation of RNA from raspberry（Rubus idaeus） fruit[J]. Molecular Biotechnology，1997，8（3）：219-221.

[10] 胡根海，喻樹迅.利用改良的CTAB法提取棉花葉片總RNA[J].棉花學(xué)報(bào)，2007，19（1）：69-70.

[11] 王玉成.檉柳抗逆分子機(jī)理研究與相關(guān)基因的克隆[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2005.

[12] 崔素萍，康振生，趙 杰，等.一種快速提取小麥葉片總RNA的方法[J].西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（2）：314-318.