何珍珍　李軍生　黃國(guó)霞　閻柳娟

摘要：繅絲汰頭中含有豐富的廢絲廢繭蛋白質(zhì)。采用酸水解法得到的游離氨基酸水解度為87.33%。利用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究氨基酸水解液添加量、溫度和通氧量對(duì)小球藻（Chlorella）和四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，氨基酸水解液的添加量為5.00%、溫度25 ℃、通氧量1.5 L/min的條件對(duì)小球藻和四尾柵藻的生長(zhǎng)有極大的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：繅絲汰頭；氨基酸水解液；小球藻（Chlorella）；四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）；細(xì)胞密度

中圖分類號(hào)：S968.41 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）09-2107-04

種桑養(yǎng)蠶以及桑蠶絲加工一直是我國(guó)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，隨著繅絲產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，繅絲汰頭廢水排放是目前繅絲企業(yè)所面臨的一個(gè)重要問題。一方面繅絲廠廢棄蛋白的排放會(huì)對(duì)自然環(huán)境造成一定的污染，另一方面廢棄蛋白中珍貴的蠶絲蛋白質(zhì)資源被浪費(fèi)[1-4]。如果能有效地利用繅絲廢棄蛋白質(zhì)生產(chǎn)魚塘氨基酸肥水劑，不但可以減輕繅絲廠傳統(tǒng)廢棄物處理的成本和壓力，而且還能切實(shí)開辟繅絲廢棄物的全新使用途徑。從汰頭中提取絲膠的方法有化學(xué)提取法和物理提取法兩大類[5]，得到的粗絲膠蛋白可與廢絲一起水解，蠶絲水解采用微波、酸、堿、氯化鈣和酶等[6-11]。水解后可得到16種氨基酸的混合物，其中包含6種人體自身不能合成的氨基酸，因此可以用于食品和化妝品的添加劑，一些含量較高的氨基酸還具有藥用價(jià)值。

氨基酸肥水劑由多種氨基酸、營(yíng)養(yǎng)鹽、微量元素、維生素及酵素菌等多種活性物質(zhì)和生長(zhǎng)因子組成，通過激活有益微生物繁殖和激活藻類細(xì)胞分裂及孢子萌發(fā)，促進(jìn)單細(xì)胞藻類新陳代謝，協(xié)調(diào)藻相與菌相平衡，促使水體迅速肥沃和維持水質(zhì)穩(wěn)定，豐富水體天然餌料，提高魚蝦幼苗成活率，促進(jìn)魚蝦生長(zhǎng)。同時(shí)能有效防止浮頭或翻塘，降低水中氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有毒物含量，減少疾病發(fā)生。氨基酸肥水劑產(chǎn)品越來越受到社會(huì)各界的普遍歡迎。

試驗(yàn)所選的小球藻（Chlorella）和四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）同屬綠藻門（Chlorophyta），是魚類在不同生長(zhǎng)時(shí)段可利用的天然水生餌料。小球藻作為單細(xì)胞微藻的一種，直徑3～8 μm，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、葉黃素、蝦黃素和多種維生素，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和提高免疫力的功能[12]，可作為魚類的開口飼料。四尾柵藻作為柵藻類的一種，直徑10～24 μm，能為魚類快速生長(zhǎng)過程提供營(yíng)養(yǎng)。本研究利用繅絲廢棄蛋白中回收的蛋白質(zhì)為材料，利用酸水解法得到氨基酸水解液，用氨基酸水解液代替無機(jī)鹽NaNO3提供氮源，研究氨基酸水解液的添加量、溫度和通氧量對(duì)小球藻和四尾柵藻生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

繅絲汰頭來自廣西鴻藝絲綢有限公司，小球藻和四尾柵藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

主要試劑：H2SO4、NaOH、HCl、甲醛、石油醚等均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

主要儀器：PHS-25CW型pH計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）、XYJ80-1型離心機(jī)（江蘇省金壇市正基儀器有限公司）、DMB5電子顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、LRH-250培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、HP-1000通氧機(jī)（廣東中山創(chuàng)新電器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 絲膠蛋白的回收 采用酸析法與離心法相結(jié)合，在繅絲汰頭廢水中加入稀HCl，調(diào)整pH為3.8～4.5，在等電點(diǎn)條件下使絲膠蛋白質(zhì)絮凝而逐漸沉淀分離[5]。取沉淀后的溶液4 000 r/min離心30 min，用抽濾裝置進(jìn)行濃縮，按固液比（m/V，g/mL，下同）為1∶10向沉淀中加入石油醚，6 ℃下密封靜置24 h，然后置于低于40 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，即為粗蛋白粉。將繅絲汰頭廢絲用清水洗凈，置于低于40 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重。

1.2.2 絲蛋白的水解 稱取1.0 g繅絲汰頭廢絲和1.0 g粗蛋白粉置于500 mL蒸餾瓶中，按固液比1∶60加入3.5 mol/L的稀H2SO4溶液，恒溫加熱攪拌器110 ℃反應(yīng)9 h[13]，冷卻，用Ba（OH）2完全中和。將中和濾液減壓過濾，取上清液4 000 r/min離心30 min，徹底除去BaSO4沉淀，得到溶液即為氨基酸水解液。水解度以水解液中氨基氮與廢棄蛋白中總氮的百分比表示[14]。

1）考察氨基酸水解液添加量對(duì)小球藻和四尾柵藻生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)氨基酸水解液處理組和1個(gè)BG11培養(yǎng)液對(duì)照組。氨基酸水解液處理組用pH 7.0的氨基酸水解液替代BG11培養(yǎng)液中的NaNO3，分別添加0.25%、0.50%、2.50%、5.00%、7.50%、10.00%、15.00%、20.00%的氨基酸水解液。每組設(shè)3個(gè)平行。溫度28 ℃，光照度5 000 lx[16]，培養(yǎng)16 d，每隔2 d于上午10∶00進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定藻細(xì)胞密度。

2）考察溫度對(duì)小球藻和四尾柵藻生長(zhǎng)的影響。將小球藻和四尾柵藻溶液分別置于10、15、20、25、30、35 ℃下，光照度5 000 lx，通氧量I.5 L/min，培養(yǎng)7 d，于每天上午10∶00進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算其平均增長(zhǎng)量。

3）考察通氧量對(duì)小球藻和四尾柵藻生長(zhǎng)的影響。將小球藻和四尾柵藻溶液以不同通氧量（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 L/min）處理，光照度5 000 lx，溫度28 ℃，培養(yǎng)7 d，于每天上午10∶00進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算其平均增長(zhǎng)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 廢絲蛋白的回收率

絲膠蛋白的等電點(diǎn)為3.8～4.5，當(dāng)絲膠蛋白溶液的pH在此范圍內(nèi)時(shí)，絲膠蛋白的絮凝量最大。因此，一般將初濾除雜的廢水pH調(diào)整至4.0，以提高絲膠蛋白的回收率。本研究中絲膠蛋白回收率為7.33%。

2.2 氨基酸水解度

水解液中氨基氮為14.03 mg/mL，水解度為87.33%。這與李勇等[13]研究的水解蠶絲及其飲料的制備中氨基酸得率為89.8%的結(jié)果基本一致。

2.3 氨基酸水解液添加量對(duì)小球藻和四尾柵藻生長(zhǎng)的影響

氨基酸水解液添加量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響如圖1所示。從圖1中可以看出，前6 d為遲緩期，各組小球藻的生長(zhǎng)緩慢；6～10 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各組小球藻的生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯不同；10～12 d為穩(wěn)定期，藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值；12～16 d為衰亡期，隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素不斷被消耗，小球藻的生長(zhǎng)受到抑制，藻細(xì)胞密度趨于平穩(wěn)；并且隨著氨基酸水解液添加量的增加，抑制作用更為明顯。添加0.25%、0.50%、2.50%、5.00%、7.50%、10.00%、15.00%、20.00%的氨基酸水解液時(shí)，小球藻的細(xì)胞密度均明顯高于對(duì)照組，說明氨基氮的添加能促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)。其中氨基酸水解液的添加量為5.00%時(shí)對(duì)小球藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最大。

氨基酸水解液添加量對(duì)四尾柵藻生長(zhǎng)的影響如圖2所示。從圖2可以看出，前6 d為遲緩期，各組四尾柵藻的生長(zhǎng)緩慢；6～10 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各組藻的生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯不同；10～12 d為穩(wěn)定期，藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值；12～16 d為衰亡期，隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素不斷被消耗，四尾柵藻的生長(zhǎng)受到抑制，藻細(xì)胞密度趨于平穩(wěn)。添加0.25%、0.50%、7.50%、10.00%、15.00%、20.00%的氨基酸水解液時(shí)，四尾柵藻的細(xì)胞密度均低于對(duì)照組，四尾柵藻的生長(zhǎng)受到抑制，并且隨著氨基酸水解液添加量的增加，抑制作用表現(xiàn)得更為明顯；添加量為2.50%和5.00%時(shí)，四尾柵藻的細(xì)胞密度明顯高于對(duì)照組。且以氨基酸水解液添加量為5.00%時(shí)對(duì)四尾柵藻的促進(jìn)作用最大。

2.4 溫度對(duì)小球藻和四尾柵藻生長(zhǎng)的影響

2.5 通氧量對(duì)小球藻和四尾柵藻生長(zhǎng)的影響

藻類進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)會(huì)利用CO2釋放出O2，培養(yǎng)基中通入大量的無菌氧氣能夠加強(qiáng)藻液混合，促進(jìn)藻細(xì)胞在光區(qū)和暗區(qū)之間循環(huán)運(yùn)動(dòng)，從而提高藻細(xì)胞密度。通氧量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響如表3所示。由表3可知，通氧量在0～1.5 L/min區(qū)間內(nèi)，隨著通氧量的增大及生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小球藻的細(xì)胞密度逐漸增大，日均增長(zhǎng)量為（15.70～19.61）×104 cells/mL，說明適量的氧氣通入會(huì)促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)，提高其繁殖速度，當(dāng)通氧量為1.5 L/min時(shí)藻細(xì)胞密度達(dá)到最大，日均增長(zhǎng)量為19.61×104 cells/mL；通氧量在2.0～2.5 L/min區(qū)間內(nèi)，隨著通氧量的增大，小球藻的細(xì)胞密度增長(zhǎng)放緩，日均增長(zhǎng)量從15.49×104 cells/mL降至10.79×104 cells/mL，說明通氧量過大會(huì)抑制小球藻的生長(zhǎng)，降低其繁殖速度。因此，小球藻的最適通氧量為1.5 L/min。

通氧量對(duì)四尾柵藻生長(zhǎng)的影響如表4所示。通氧量在0～1.5 L/min時(shí)，隨著通氧量的增加及生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，四尾柵藻的細(xì)胞密度逐漸增大，日均增長(zhǎng)量為（15.91～19.34）×104 cells/mL，表明少量的氧氣通入會(huì)促進(jìn)四尾柵藻的生長(zhǎng)，提高其繁殖速度，當(dāng)通氧量為1.5 L/min時(shí)，藻細(xì)胞密度達(dá)到最大，日均增長(zhǎng)量為19.34×104 cells/mL；通氧量在2.0～2.5 L/min區(qū)間內(nèi)，隨著通氧量的增加，四尾柵藻的細(xì)胞密度增長(zhǎng)放緩，日均增長(zhǎng)量從16.99×104 cells/mL降至10.79×104 cells/mL，表明大量的氧氣通入會(huì)抑制四尾柵藻的生長(zhǎng)，其繁殖速度受到影響。因此，四尾柵藻的最適通氧量為1.5 L/min?？赡苁钱?dāng)光照到培養(yǎng)液表面時(shí)，藻本身對(duì)光有遮擋作用，故入射光穿透培養(yǎng)液時(shí)存在不斷衰減的現(xiàn)象，且隨著藻細(xì)胞密度的增加，這種光衰減現(xiàn)象會(huì)不斷加重，增加通氧量會(huì)加強(qiáng)培養(yǎng)液的混合，使每一個(gè)藻細(xì)胞接受均等的光照機(jī)會(huì)。但通氧量過大使之對(duì)細(xì)胞的剪切力加大，反而不利于藻的生長(zhǎng)[19]。同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)液中氧氣過量能夠降低藻類對(duì)CO2的利用，抑制藻類的自養(yǎng)生長(zhǎng)，繁殖速度降低。

3 結(jié)論

本研究以繅絲廠汰頭廢棄蛋白中回收的蛋白質(zhì)為材料，將絲膠蛋白回收技術(shù)與繅絲汰頭處理相結(jié)合，研究制備一種氨基酸肥水劑。利用酸析法與離心法相結(jié)合的方法回收繅絲汰頭廢水中的絲膠蛋白，回收率達(dá)7.33%。蛋白質(zhì)水解得到的游離氨基酸的水解度為87.33%。用氨基酸水解液代替無機(jī)鹽NaNO3提供氮源，當(dāng)氨基酸水解液的添加量為5.00%時(shí)小球藻和四尾柵藻的生長(zhǎng)狀況最好。小球藻和四尾柵藻生長(zhǎng)最適溫度為25 ℃，最適通氧量為1.5 L/min。從本研究結(jié)果可以看出，利用繅絲廠廢棄蛋白的氨基酸水解液代替無機(jī)鹽NaNO3對(duì)小球藻和四尾柵藻的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。在以后的研究中可以通過改變培養(yǎng)液中P、S、Mg等元素的濃度以及添加有益菌群和維生素，制備出一種最適合藻類生長(zhǎng)的氨基酸魚塘肥水劑。

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