腹膜透析(PD)是慢性腎臟病一體化治療的主要替代治療方法之一。腹膜纖維化是維持性腹膜透析患者常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，是各種原因?qū)е赂鼓栴}的最終轉(zhuǎn)歸，是導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)改變和超濾功能喪失，致使患者退出PD的主要原因之一[1]。無論是反復(fù)發(fā)生的腹膜炎，還是非生物相容性的PD液或PD液在加熱處理過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，都是引起腹膜纖維化的常見原因[2,3]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的裂解成分，是該類細(xì)菌的主要致病因素之一。腹膜間皮細(xì)胞(PMC)是腹膜發(fā)揮透析作用的主要細(xì)胞群，在調(diào)節(jié)腹膜功能，抑制炎癥和纖維化方面起關(guān)鍵作用[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，以高糖為主的PD液、多種炎癥細(xì)胞因子等可導(dǎo)致PMC發(fā)生向肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(EMT)，是PMC發(fā)生纖維化的早期階段。大量的研究表明，機(jī)體必需微量元素鋅(Zn)是機(jī)體多種酶的必需組分或激活因子，參與多種信號通路的傳導(dǎo)，具有抗炎、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激的作用[5,6]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究Zn對LPS誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞(RPMCs)的EMT的影響，從而為Zn在PD中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

材料

實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD雄性大鼠，體重120～160 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

主要試劑 DMEM/F12干粉培養(yǎng)基和胎牛血清(美國GIBCO)、胰蛋白酶、兔抗大鼠肌動蛋白α(α-SMA)、脂多糖粉劑(美國Sigma)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日)、兔抗大鼠核因子κB(NF-κB)、NF-κB抑制蛋白(I-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、磷酸化I-κB(p-I-κB)、上皮鈣黏素(E-cadherin)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)抗體(Santa-Cruz)。

方法

大鼠腹膜間皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，傳代與鑒定 局麻后無菌取大鼠大網(wǎng)膜，在PBS中洗去紅細(xì)胞，然后用含0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA的PBS液消化(37℃) 20～25 min，之后棄去消化液再加入胎牛血清(FBS)終止消化，吹打收集消化下來的單個細(xì)胞， 4℃下離心(800 r/min,5 min)，得到細(xì)胞團(tuán)，用DMEM/F12培養(yǎng)液(含青霉素、鏈霉素100 U/ml及20% FBS) 重懸細(xì)胞，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在CO2孵箱中培養(yǎng)24h后首次換液,以后每2～3d換液1次。待細(xì)胞融合達(dá)80%時傳代，用PBS 洗1次后，加0.125%胰蛋白酶2 ml室溫消化3 min， 用FBS終止消化，4℃離心，細(xì)胞團(tuán)用DMEM/F12 生長液重懸， 以2×106個/ml的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后首次換液，以后每2～3 d換液1次。第2代被培養(yǎng)的細(xì)胞匯合至90%時經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察并用細(xì)胞角蛋白抗體及波形蛋白抗體行免疫組化染色進(jìn)行鑒定， 明確其為RPMC，純度>99%。第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[10]。

實(shí)驗(yàn)分組 第3代腹膜間皮細(xì)胞達(dá)90%融合時(細(xì)胞數(shù)約為5×106)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，用1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h同步化后，隨機(jī)分為下列各組：(1)正常對照組：只加DMEM/F12培養(yǎng)基；(2)LPS組： 100 μg/ml LPS作用48h；(3)硫酸鋅(ZnSO4)作用組：30 μmol/L ZnSO4作用24h后加100 μmol/L LPS作用48h。LPS及ZnSO4的濃度選擇均采用四哩鹽比色(MTT)間接法觀察TP在不同時間段和不同劑量下殺傷活性的變化篩選，具體參照文獻(xiàn)[11]。

RPMCs增生率測定 RPMCs接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.1 ml培養(yǎng)基，24h后細(xì)胞貼壁，更換培養(yǎng)液，分別加入100 μg/ml LPS、 30 μmol/L ZnSO4、100 μg/ml LPS復(fù)合培養(yǎng)44h后。每孔加MTT 10 μl，4h 后， 吸凈培養(yǎng)液，加入 DMSO 150 μl，振蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測量490 nm波長的吸光度值。

免疫熒光 RPMCs轉(zhuǎn)至24孔板，分組處理同前，每組設(shè)4復(fù)孔，多聚甲醛固定，0.3% Triton-X 破膜，BSA室溫孵育30 min。一抗4℃孵育過夜，羊抗鼠Alexa Fluor 488標(biāo)記熒光二抗室溫下孵育120 min。熒光顯微鏡下觀察E-cadherin、Collagen Ⅰ的表達(dá)。E-cadherin、Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)的信號呈綠色熒光。

半定量RT-PCR檢測 提取細(xì)胞總RNA,按照TRIzol Reagent說明書進(jìn)行操作。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國MBI)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用引物為：α-SMA ( 5′-GCTCTGTAAGGCGGGCTTTG-3’，5′-AAGACGGAATAGCCACGCTCA-3′)；E-cadherinsense(5′-CAGGATTACAAGTTCCCG-3，5’-G￣A￣C￣T￣G￣T￣C￣C￣G￣C￣T￣G￣C￣C￣T￣T￣C￣A￣C-3’)；Collagen Ⅰ(5′-G￣C￣G￣T￣A￣A￣C￣G￣A￣T￣G￣G￣T￣G￣C￣T￣G￣T￣C￣G￣G-3′，5′-A￣T￣A￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣A￣A￣C￣T￣C￣C￣A￣G￣T￣A￣A-3′)；PCR擴(kuò)增后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離觀察，成像，Image-pro Plus 6.0軟件包分析。

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，采用活性氧(ROS)檢測試劑盒檢測各組別的ROS表達(dá) 細(xì)胞內(nèi)的ROS水平采用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于100 mm 培養(yǎng)皿中。在含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，加入處理藥物作用48h，CCCP做陽性對照。使用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基洗細(xì)胞1次，加入終濃度30 μmol/L的DCFH-DA 于37℃孵育1h，每5 min震蕩細(xì)胞一次。用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，藥物處理細(xì)胞，常規(guī)消化，DCFH-DA染色，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur,Becton-Dickinson,USA)進(jìn)行檢測，CellQuestTM軟件 (Becton-Dickinson)分析并計算ROS陽性率。

Western Blot法檢測NF-κB、 I-κB、 p-NF-κB、 p-I-κB蛋白表達(dá) 冰上裂解細(xì)胞，4℃ 12 000 r/min離心5 min，留取上清用Bradford法測定蛋白濃度?？偟鞍咨蠘佑?2% SDS-PAGE膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉60 min后，分別加入兔抗大鼠NF-κB、 I-κB、，p-NF-κB、 p-I-κB抗體，小鼠抗大鼠β-actin抗體(1∶1 000，北京中杉金橋)，4℃過夜，洗膜，分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 500 ，北京中杉金橋)、山羊抗小鼠IgG(1∶1 500，北京中杉金橋),室溫孵育2h，洗膜，ECL發(fā)光法顯影，掃描儀成像，自動成像系統(tǒng)分析。

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，樣本均數(shù)間的兩兩比較采用Tukey’s 檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

MTT測定RPMCs增生測定MTT實(shí)驗(yàn)吸光度值反映各組細(xì)胞數(shù)目。對照組MTT結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時間延長各組細(xì)胞吸光度明顯增加。LPS明顯抑制RPMCs的增生， 培養(yǎng)48h MTT吸光度值與對照組相比明顯降低，而加入ZnSO4培養(yǎng)48h MTT吸光度值明顯高于LPS組 (圖1)。

圖1 MTT法測定細(xì)胞增生率

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果LPS培養(yǎng)48h后細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化，由典型的上皮逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形，類似肌成纖維細(xì)胞，而ZnSO4作用組細(xì)胞表型改變明顯減輕。同時LPS組RPMCs 的E-cadherin熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱，而Collagen Ⅰ 熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，與此相比，ZnSO4作用組E-cadherin熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng) 、 Collagen Ⅰ熒光表達(dá)強(qiáng)度下降(圖2)。

ZnSO4對LPS誘導(dǎo)的RPMCs的α-SMA、E-cadherin、Collagen Ⅰ基因表達(dá)的影響為了檢測Zn對LPS誘導(dǎo)的RPMCs的EMT的影響，我們采用 RT-PCR 檢測α-SMA、E-cadherin、Collagen Ⅰ基因表達(dá)，LPS可導(dǎo)致α-SMA 和Collagen Ⅰ的上調(diào)表達(dá)，補(bǔ)充鋅可明顯抑制LPS引起的α-SMA 和Collagen Ⅰ的表達(dá)。我們同時發(fā)現(xiàn)，LPS可下調(diào)E-cadherin的基因表達(dá)，補(bǔ)充鋅可明顯逆轉(zhuǎn)LPS引起的E-cadherin基因的下調(diào)表達(dá)(圖3)。以上結(jié)果證實(shí)補(bǔ)充鋅可有效減輕RPMCs發(fā)生EMT。

圖2 大鼠腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin及Collagen Ⅰ染色結(jié)果(IF，×400)

圖3 ZnSO4對LPS誘導(dǎo)的RPMCs的α-SMA、E-cadherin、Collagen Ⅰ基因表達(dá)的影響

ZnSO4對LPS誘導(dǎo)的RPMCs的ROS產(chǎn)生的影響既往文獻(xiàn)證實(shí)，氧化應(yīng)激在PMC的EMT及腹膜纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[12,13]。抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)可有效地逆轉(zhuǎn)或阻抑PMC的EMT進(jìn)程，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)在腹膜間皮細(xì)胞的EMT中起關(guān)鍵作用。因此，為了檢測Zn對RPMCs的EMT影響及其機(jī)制，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，采用ROS檢測試劑盒檢測各組別的ROS表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組ROS產(chǎn)生明顯增多，而補(bǔ)充鋅可明顯減少LPS引起的ROS產(chǎn)生(圖4)。以上結(jié)果提示，Zn可能是通過抑制LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮阻抑RPMCs的EMT的作用。

圖4 ZnSO4對LPS誘導(dǎo)的RPMCs的ROS表達(dá)的影響

ZnSO4對LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的影響既往的文獻(xiàn)證實(shí)NF-κB信號通路在多種細(xì)胞發(fā)生EMT過程中發(fā)揮重要的作用[14]。我們推測，Zn可能通過此通路對LPS誘導(dǎo)的RPMCs的 EMT進(jìn)行調(diào)節(jié)。我們應(yīng)用Western Blot檢測各組別NF-κB通路關(guān)鍵蛋白NF-κB、I-κB的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，各組NF-κB、I-κB的總表達(dá)變化不明顯， LPS組細(xì)胞的p-NF-κB、p-I-κB表達(dá)明顯升高。而補(bǔ)充鋅能夠明顯降低LPS引起的p-NF-κB、 p-I-κB的上調(diào)表達(dá)。這表明Zn可通過抑制NF-κB 信號通路的活化進(jìn)而阻抑RPMCs的EMT(圖5)。

圖5 NF-κB，I-κB表達(dá)的Western Blot檢測結(jié)果

討 論

PD相關(guān)性腹膜炎是PD患者最常見的感染因素，是導(dǎo)致患者死亡率增高及患者退出PD的重要原因之一。PMC在維持腹膜對感染的宿主防御反應(yīng)中起重要作用。然而，近來研究發(fā)現(xiàn)，長期以高糖為主的腹膜透析液(PDF)，多種炎癥因子的刺激可以導(dǎo)致PMC發(fā)生EMT[15]。PMC發(fā)生EMT是PD患者腹膜功能逐漸降低的關(guān)鍵因素之一。既往的研究證實(shí)，補(bǔ)充鋅能夠抑制或減輕一些動物模型的纖維化和臨床上的慢性炎癥疾病，而鋅缺乏能夠加重或?qū)е吕w維化[9]。文獻(xiàn)證實(shí)，終末期腎病(ESRD)患者(包括血液透析和PD患者)均存在不同程度的鋅缺乏[7,8]。因此，我們有理由推測Zn可能對腹膜的纖維化有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)中，LPS可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的RPMCs發(fā)生EMT，而補(bǔ)充鋅可有效抑制EMT。另外，補(bǔ)充鋅明顯抑制LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和NF-κB信號通路的活化，其可能是Zn發(fā)揮抗EMT作用的重要機(jī)制之一。

EMT是發(fā)生腹膜纖維化早期病變的關(guān)鍵。以高糖為主的PDF、多種炎性細(xì)胞因子等可導(dǎo)致PMC向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，并且EMT而來的肌纖維母細(xì)胞可能是參與腹膜纖維化的主要細(xì)胞。因此，臨床上對EMT的防治可能會延緩腹膜纖維化的進(jìn)程。E-cadherin是一種細(xì)胞間黏附分子，存在于正常上皮細(xì)胞的連接處，是細(xì)胞之間連接的關(guān)鍵物質(zhì)。E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，α-SMA表達(dá)上調(diào)以及細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白的增多是EMT的重要特征。其中Collagen Ⅰ具有代表性，因此我們選用了Collagen Ⅰ作為EMT的觀察指標(biāo)之一，并檢測其基因和蛋白水平的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS組RPMCs的標(biāo)記蛋白E-cadherin mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，α-SMA、Collagen Ⅰ mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。免疫熒光結(jié)果也提示E-cadherin、Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)與基因表達(dá)趨勢一致。這些結(jié)果證實(shí)LPS能誘導(dǎo)RPMCs發(fā)生EMT。而添加ZnSO4后，α-SMA、Collagen Ⅰ的表達(dá)顯著降低，E-cadherin的表達(dá)升高。而且細(xì)胞表型由間皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞表型改變也明顯減輕，提示ZnSO4具有潛在抑制RPMCs 發(fā)生EMT的作用。

Himmelfarb等[16]和Karamouzis等[17]研究證實(shí)， 長時間進(jìn)行透析的ESRD的患者隨著透析時間的延長，氧化應(yīng)激損傷的程度也隨之增加。近年研究進(jìn)一步表明，氧化應(yīng)激在PMC的EMT及腹膜纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[12,13]。以高糖為主導(dǎo)的PDF及炎癥過程中產(chǎn)生的LPS、炎癥因子等可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)使PMC產(chǎn)生過多的ROS，可誘導(dǎo)PMC發(fā)生EMT[18]。腎小管上皮細(xì)胞、肝纖維化中星狀細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞的EMT與氧化應(yīng)激的關(guān)系也被證實(shí)，同時降低脂質(zhì)過氧化水平，可抑制EMT[19]。Zn和氧化應(yīng)激反應(yīng)及纖維化的關(guān)系也被眾多的研究證實(shí)。鋅缺乏可以引起氧化應(yīng)激進(jìn)而損傷細(xì)胞器、破壞細(xì)胞膜或細(xì)胞功能、引起細(xì)胞凋亡、EMT及纖維化[20,21]。相反，補(bǔ)充鋅能夠通過減少ROS的產(chǎn)生下調(diào)氧化應(yīng)激反應(yīng)。 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LPS可導(dǎo)致細(xì)胞ROS表達(dá)量升高，而加入ZnSO4后能夠減少ROS的表達(dá)量，提示鋅阻止或減輕EMT可能是通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)。

NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是各種細(xì)胞發(fā)生EMT的基本和關(guān)鍵通路之一[13,14]，NF-κB最常見的形式是由p50/p52亞單位與p65亞單位形成的二聚體，正常情況下存在于胞質(zhì)，與抑制性因子I-κB結(jié)合成復(fù)合物。應(yīng)激、病原體或促炎癥因子等激活I(lǐng)-κB激酶(IKK)使I-κB磷酸化，進(jìn)而通過泛素化途徑降解I-κB，釋放NF-κB入核，與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，啟動促炎癥因子、纖維化因子等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。我們前期的研究也表明，LPS可導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1) 和TNF-α在RPMCs的高表達(dá)， 促進(jìn)RPMCs發(fā)生EMT(未發(fā)表資料)。 Zn能夠抑制NF-κB的表達(dá)已經(jīng)在多種細(xì)胞被證實(shí)，其主要是通過抑制I-κB的磷酸化進(jìn)而抑制NF-κB的活化[22,23]。我們發(fā)現(xiàn)各組的總的NF-κB、I-κB的表達(dá)變化不明顯， LPS組細(xì)胞的p-NF-κB、p-I-κB表達(dá)明顯升高。而補(bǔ)充鋅能夠明顯降低LPS引起的p-NF-κB、p-I-κB的上調(diào)表達(dá)。提示ZnSO4可以直接與NF-κB的亞基p65/p50結(jié)合，也可抑制I-κB的活化，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，降低了NF-κB與DNA結(jié)合活性，抑制NF-κB的DNA合成，從而抑制其表達(dá)。

LPS 可誘導(dǎo) RPMCs發(fā)生EMT，ZnSO4能在一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的RPMCs發(fā)生EMT，這一作用可能與其抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化有關(guān)。提示Zn在PD相關(guān)性炎性反應(yīng)中對PMC具有一定的保護(hù)作用，為PD相關(guān)腹膜炎及腹膜纖維化的防治提供了新的實(shí)驗(yàn)材料。

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