腹膜透析(PD)是尿毒癥的一種腎臟替代治療方式。PD過程中蛋白質(zhì)丟失是造成患者蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良的一個重要原因。既往研究發(fā)現(xiàn)，每日經(jīng)PD液丟失的蛋白質(zhì)約4.14±1.91g[1]，但丟失的原因目前并未完全明確。腹膜具有分子屏障及電荷屏障[2]，我們前期的臨床研究及動物實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在尿毒癥和PD兩種狀態(tài)下腹膜電荷屏障均受到損害，且大鼠PD液電荷屏障的變化及PD液白蛋白之間存在顯著的負相關(guān)性，因此判斷PD大鼠腹膜負電荷屏障被破壞，增加了白蛋白的漏出。

肝素具有負電荷，可與腎小球基膜上的負電荷互補[5]，減少尿蛋白漏出。那么，肝素是否能夠改善腹膜電荷屏障，進而減少蛋白質(zhì)丟失，目前均未明確，本文將對此進行研究，以便為臨床防止PD蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良提供理論依據(jù)。

材料與方法

材料總淀粉酶和胰淀粉酶試劑盒購置英國Landox公司。淀粉酶抑制劑購置Sigma公司。

實驗動物體重為160～180g的SPF級雄性SD大鼠40只(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)。隨機分為4組：(1) 尿毒癥組(n=10)：5/6腎切除制作尿毒癥大鼠模型，應(yīng)用生理鹽水10 ml/次，2次/d行PD。(2) PD組(n=10)：制作尿毒癥大鼠模型，建模后制作PD大鼠模型[6];應(yīng)用百特PD液進行PD，10 ml/次，2次/d。(3)對照組(假手術(shù)組，n=10)，即未切除腎臟的大鼠,也采用生理鹽水10 ml/次，2次/d行PD。(4)肝素組(n=10)，10 ml PD液加普通肝素1 mg/(kg·次)，2次/d[7]。

所有大鼠PD 4周后收集血清及PD液，測定血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)及淀粉酶。同時在PD進行2h后留取10 ml PD液，并收集24h PD液計量(Pv)，測定PD液蛋白(Pp)。

電荷屏障的測定采用清除法測定血清、PD液總淀粉酶及胰淀粉酶，具體方法見試劑盒(分別為 Stam、Ptam、Spam和Ppam)。 血清和PD液唾液淀粉酶(Ssam和Psam)的計算參照O’Donnell 等方法進行[7]。

電荷屏障的計算：分別計算PD對pam的清除率(Cpam)和sam的清除率(Csam)，即Camy=(PD液淀粉酶濃度×Pv)/血液淀粉酶濃度。再將Cpam/Csam作為評價腹膜電荷屏障的指標。

統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析。組間比較采取Kruskal-Wallis H檢驗法進行方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

大鼠腹膜電荷特性對照組、尿毒癥組、PD組及肝素組腹膜Cpam/Csam分別結(jié)果為1.91±0.89、2.32±0.74、3.11±0.76和2.24±0.59，尿毒癥組與PD組及對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.009和0.003)，但尿毒癥組和PD組間無統(tǒng)計學(xué)意義。肝素組的Cpam/Csam顯著低于PD組 (P=0.008)，但和對照組、尿毒癥組相比無明顯差異(圖1)。

圖1 各組大鼠腹膜電荷屏障比較

PD對白蛋白、SCr、BUN的清除情況對照組、尿毒癥組、PD組及肝素組PD液白蛋白質(zhì)丟失量分別為27.1±5.66 mg、41.3±8.34 mg、49.2±3.61 mg及39.9±3.73 mg。其中尿毒癥組、PD組PD液白蛋白量顯著高于對照組(P=0.0003，P=0.0002及P=0.0002)；同時PD組還高于尿毒癥組(P=0.04)，肝素組與PD組相比，PD液白蛋白丟失量顯著降低(P=0.001)，均有統(tǒng)計學(xué)差別。另外，尿毒癥組、PD組以及肝素組SCr及BUN水平高于對照組，血清白蛋白均顯著低于對照組；同時PD組SCr以及BUN還顯著低于尿毒癥組，有統(tǒng)計學(xué)差別(表1)。

腹膜電荷屏障與PD液白蛋白量的相關(guān)性我們對所有大鼠腹膜電荷屏障與PD液白蛋白量進行Spearman相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果顯示兩者顯著負相關(guān)(r=-0.469,P=0.002)。

表1 不同組別PD液白蛋白丟失量、SCr和BUN水平比較a

表2 腹膜電荷屏障與PD液白蛋白量的相關(guān)性

討 論

腹膜具有分子屏障及電荷屏障[2]，當負電荷屏障受損后，則攜帶負電荷的白蛋白等物就可通過這些半透膜，造成蛋白質(zhì)丟失，從而影響血清白蛋白水平。目前檢測電荷屏障的方法有染色法、免疫組織化學(xué)法、生物化學(xué)測定法、同位素法及清除法。除清除法適用于活體研究外，其他方法因繁瑣而不適用于臨床，也不能精確定量電荷屏障的改變程度。清除法目前主要采用內(nèi)生蛋白為示蹤物，如體內(nèi)兩種淀粉酶同工酶，胰淀粉酶(Pam)和唾液淀粉酶(Sam)。Pam與Sam 分子半徑均為2.9 nm，相對分子質(zhì)量均為56 000。兩者等電點不同，Pam為7.0，Sam為5.9～6.4[8]。其原理是利用血中兩分子半徑相同，因受電荷屏障的作用，帶負電荷較多分子的清除率將比帶負電荷少的多，利用此原理，測定兩種物質(zhì)清除率比值即Cpam/Csam，即可在活體反映腎小球電荷屏障(GCB)的狀態(tài)，正常成人腎臟Cpam/Csam為3.2(2.1～6.1)。當電荷屏障損害時，兩種分子的清除率比值將發(fā)生變化，比值越高則提示損害越嚴重[9,10]。

尿毒癥是一種微炎癥狀態(tài)，PD是其主要的治療方式之一，但PD液可能會影響腹膜血管內(nèi)皮細胞糖蛋白合成，損害電荷屏障。因此本文觀察透析液能否損傷腹膜電荷屏障，討論的是PD液的不良反應(yīng)。我們參考國內(nèi)文獻[6]，對假手術(shù)組和尿毒癥組大鼠用生理鹽水灌腹，對實驗組及肝素組大鼠用1.5%透析液灌洗腹腔結(jié)果顯示，尿毒癥及PD兩種狀態(tài)下Cpam/Csam的比值均高于對照組，提示腹膜電荷屏障均受到損害，而PD組電荷屏障損害較尿毒癥組更為顯著。有學(xué)者報道持續(xù)性不臥床腹膜透析(CAPD)患者對大分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運清除主要是分子選擇性的，可能沒有電荷屏障的作用[11]。然而，本研究中所有大鼠PD液Cpam/Csam比值和PD液白蛋白間存在顯著的負相關(guān)，因此判斷PD大鼠腹膜負電荷屏障被破壞，增加了白蛋白的漏出。

對于肝素能否改善腹膜電荷屏障，至今未見相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，大鼠PD液Cpam/Csam比值顯著低于PD組，提示其可能通過補充腹膜的負電荷，改善其屏障功能，進而減少白蛋白經(jīng)腹膜丟失，結(jié)果顯示PD液中蛋白質(zhì)丟失量顯著減少。

綜上所述，我們認為正常情況下腹膜具有電荷特性，尿毒癥時腹膜電荷特性受損，可導(dǎo)致PD液蛋白的丟失，而PD會進一步增加蛋白質(zhì)的丟失。補充肝素可顯著改善腹膜電荷屏障，減少蛋白質(zhì)的丟失量。但本研究未將大鼠處死再用前述其他方法來測定大鼠腹膜電荷屏障，我們將在今后的研究中采用不同方法進行檢測，比較其優(yōu)缺點。

1 俞國慶,陳建,莊永澤,等.持續(xù)非臥床腹膜透析與蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良的相關(guān)因素分析.臨床腎臟病雜志,2008,8(5):221-222.

2 Lyepoldt JK,Henderson LW.Molecular change influences transperitoneal macromolecule transport.Kidney Int,1993,43(4):837-844.

3 俞國慶,文文,陳建,等.腹膜透析患者腹膜電荷屏障對透析液蛋白質(zhì)丟失的影響.腎臟病與透析腎移植雜志,2008,17(4):335-338.

4 俞國慶,文文,陳祖醫(yī),等.尿毒癥大鼠腹膜電荷屏障變化以及腹膜透析對其影響.中華腎臟病雜志,2008,24(11):847-849.

5 Kborana AA，Sahni A，Ahland OD，et al.Heparin inhibition of endothelial cell proliferation and organization is dependent on molecular weight.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23(11):2110-2115.

6 袁江姿，錢家麒，方煒,等.尿毒癥腹透對大鼠腹膜形態(tài)和功能的影響.上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2007,27(10):1189-1192.

7 Schilte MN,Loureiro J,Keuning ED,et al.Long-term intervention with heparins in a rat model of peritoneal dialysis.Perit Dial Int,2009,29(1):26-35.

8 O’Donnell MD,FitzGerald O,McGeeney KF.Differential serum amylase determination by use of an inhibitor,and design of a routine procedure.Clin Chem,1977,23(3):560-566.

9 Fox JG,Quin JD,O'Reilly DS,et al.Assessment of glomerularcharge selectivity in man by differential clearance of isoamylases.Clin Sci (Lond),1993,84(4):449-454.

10 Thum CN，Oelbaum RS，F(xiàn)oo AY，et al.Renal isoamylase clearance as a measurement of altered renal charge selectivity in patients with diabetes mellitus.Ann Clin Biochem,1993,35(PT 5):449-453.

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