環(huán)孢素A(CsA)是一種強效免疫抑制劑，臨床主要用于預防同種異體腎、肝、心臟等器官或組織移植所發(fā)生的排斥反應，也用于預防及治療骨髓移植時發(fā)生的移植物抗宿主反應，由于臨床應用CsA使移植器官存活率提高了80％～90％。但CsA治療指數窄，個體差異較大，血藥濃度過高可引起肝腎毒性，過低則易發(fā)生排斥反應。因此，監(jiān)測CsA在全血的濃度，調整其濃度在安全有效范圍具有重要的臨床意義[1]。

目前，測定環(huán)孢素血藥濃度的方法主要有高效液相色譜(HPLC)法、熒光偏振免疫(TDx)法、高效液相質譜聯(lián)用(LC/MS)法、高效毛細管電泳(HPCE)法、放射免疫(RIA)法和受體結合(RBA)法[2-4]。由于血藥濃度監(jiān)測方法不統(tǒng)一，監(jiān)測結果存在很大差異，根據不同方法所確定的治療藥物濃度范圍也不同，這給臨床應用和評價帶來不便。國內外均有報道關于各種測定方法間比較[4-7]，國內醫(yī)院多采用單克隆TDx法，此法對環(huán)孢素的體內代謝產物產生交叉免疫反應，實際測得結果為CsA及代謝物之和。HPLC法測定結果為CsA原型藥物濃度，因此能更準確地說明藥物濃度、療效、不良反應三者間的關系[8]。為更好地指導臨床合理用藥， 本研究擬以TDx監(jiān)測方法為參照，對CsA全血樣本進行HPLC分析，考察兩種方法的相關性。

對象與方法

樣品來源標本全部來自南京軍區(qū)福州總醫(yī)院泌尿外科、血液科、腎內科住院患者和門診隨訪患者常規(guī)監(jiān)測全血樣本。本試驗分別用HPLC法和TDx法對92例患者的全血標本進行了檢測。

儀器Agilent1200 HPLC儀(美國Agilent公司)；AL204精密電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)； LD5-2A型臺式離心機(北京醫(yī)院離心廠)；TGL-16C高速臺式離心機 (上海安寧科學儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)； BF2000氮氣吹干儀(北京八方世紀科技有限公司)；熒光偏振免疫分析儀(TDxFLx，美國Abbott公司)。

試劑CsA試劑盒(批號:69398Q101,美國Abbott公司)；CsA質控盒(120085JN00 2012-04-07)。CsA對照品(福建科瑞醫(yī)藥有限公司，批號：130495．200202，純度99．7％)；環(huán)孢素D(CsD)對照品(福建科瑞醫(yī)藥有限公司，批號：0104006 416，純度99.0％)；乙腈、甲醇(色譜純；上?？曝S化學試劑有限公司)；正己烷(分析純；上海科豐化學試劑有限公司)；乙醚(分析純；上海聯(lián)試化工試劑有限公司；使用前重蒸餾)。

HPLC法測定血藥濃度

色譜條件 色譜柱為Inertsil CN(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈∶水(38∶62，v/v)；流速1.0 ml/min；檢測波長210 nm；進樣量20 μl；柱溫55℃。

對照品溶液的制備 CsA溶液的配制：稱取CsA對照品約10 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1000 mg/L的CsA儲備液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用前取出平衡至室溫后，取適量儲備液用甲醇稀釋成濃度分別為40 ng/ml、80 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、800 ng/ml、1200 ng/ml和2500 ng/ml的CsA對照品溶液。

CsD內標液的配制：稱取CsD對照品約10 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1000 mg/L的CsD儲備液。精密量取該儲備液1 ml，置于25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為40 mg/L的CsD內標溶液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

血樣處理方法 取1.0 ml全血樣品置15ml玻璃離心管中，加入10 μl內標液(相當于400 ng CsD)、500 μl 0.2 mol/L NaOH溶液，渦旋30s，加入5 ml重蒸乙醚，渦旋提取3 min，4000 r/min離心10 min，取乙醚層4 ml于5 ml的離心試管中，40℃氮氣吹干，加入水∶乙腈(1∶1)100 μl復溶，渦旋30s，加入200 μl正己烷(用乙腈飽和)，渦旋30s，4000 r/min離心15 min，取下層溶液進樣分析。

方法專屬性 取空白全血1 ml，除不加內標外，按“血樣處理方法”項下全血樣品處理方法操作，進樣20 μl，記錄色譜圖；將一定濃度CsA和內標溶液加入空白全血，依同法操作，記錄色譜圖；取受試者服藥后收集的血液樣品，依同法操作，記錄色譜圖(圖1)。結果表明，空白全血中內源性物質不干擾CsA和內標的測定。

圖1 CsA高效液相色譜圖

標準曲線繪制 取空白全血1ml，加入“對照品溶液的制備”項下CsA對照品各溶液10 μl，配制成相當于CsA濃度為40 ng/ml、80 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、800 ng/ml、1200 ng/ml和2500 ng/ml的模擬人全血樣品，按“血樣處理方法”項下全血樣品處理方法操作，進樣20μl，記錄色譜圖。以待測物濃度為橫坐標(X)，待測物與內標物峰面積比值為縱坐標(Y)，用加權(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程為：Y=2.209×10-3X+3.841×10-2，r=0.9997。結果表明，CsA在40～2500 ng/ml濃度范圍內線性關系良好，定量限為40 ng/ml。

精密度和準確度 取空白全血1 mL，按“標準曲線繪制”項下方法配制CsA低、中、高三個濃度(分別為80 ng/ml、400 ng/ml、2000 ng/ml)標準全血樣品，按“血樣處理方法”項下全血樣品處理，每一濃度進行5個樣本分析，連續(xù)測定3d，記錄測得濃度，計算日內、日間精密度和回收率(表1)。

表1 精密度和準確度結果

樣品穩(wěn)定性 取空白全血1 ml，按“標準曲線繪制和定量下限”項下方法配制CsA低、中、高三個濃度(分別為80 ng/ml、400 ng/ml、2000 ng/ml)質量控制(QC)生物樣品，于室溫放置8 h、-20 ℃冷凍放置30d和經三次冷凍-解凍循環(huán)處理后，考察樣品穩(wěn)定性。每批次5樣本分析。結果表明CsA人全血樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好(表2)。

表2 人全血樣品中環(huán)孢素A穩(wěn)定性考察結果(n=5)

TDx法測定血藥濃度精密吸取被檢標本全血150 μl，放入離心管中，加入50 μl細胞溶解劑，再加入CsA蛋白沉淀劑300 μl，充分振蕩后，離心，取上清液置TDxFLX儀器內，將CsA試劑盒放入儀器內進行測定。

統(tǒng)計學分析數據以均數±標準偏差表示，數據分析采用SPSS 17.0軟件。分別用TDx法和HPLC法測得92例全血中CsA濃度，將TDx法測定的結果作為橫坐標(X) ，HPLC法測定的結果為縱坐標(Y)，進行線性回歸，評價兩組數據的相關性。用配對t檢驗評價2種方法測定結果有無差異。通過計算 “(TDx法測定濃度-HPLC法測定濃度)/ HPLC法測定濃度×100％”的值來描述兩種方法之間的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為統(tǒng)計學差異顯著。

結 果

TDx法和HPLC法測定患者血中CsA濃度的相關性研究采集本院腎移植受者常規(guī)監(jiān)測全血樣本92例，分別用HPLC和TDx 兩種方法同時進行測定(92例血樣在不同的工作日采集并平行測定)。TDx法(X)與HPLC法(Y)測定的CsA血藥濃度結果見圖2。

圖2 HPLC法和TDx法測定CsA血藥濃度的相關性

對兩種方法測定的結果進行線性回歸分析，X與Y 的回歸方程為Y=0.826X+8.318 ，r=0.9665，遠大于不相關臨界值，即兩種方法有較好的相關性。用配對t檢驗評價兩種方法測定結果是否存在差異，結果顯示，在95％置信區(qū)間內兩者在統(tǒng)計學上存在顯著性差異(P<0.01)。通過計算 “(TDx法測定濃度-HPLC法測定濃度)/HPLC法測定濃度×100％”的均值可知，TDx法測定結果比HPLC法測定結果平均高出25.44％。

TDX法和HPLC法測定標準全血樣品中CsA濃度的相關性研究取空白全血，按“標準曲線繪制”項下方法配制CsA低、中、高三個濃度(分別為80.0 ng/ml、400 ng/ml、2000 ng/ml)標準全血樣品，分別用TDx和HPLC兩種方法進行測定，每一濃度進行5個樣本分析，用t檢驗評價兩種方法測定結果是否存在差異(表3)。

表3 兩種方法測定標準全血中環(huán)孢素A的結果(n=5)

以上結果顯示，HPLC法測定結果與實際值較接近(RE<3％)，TDx法測定結果比HPLC法測定結果高出約10％，但低濃度時兩組間無明顯差異(P>0.05)，中、高濃度時兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

討 論

CsA在血漿中與血漿蛋白和紅細胞的結合率很高，且在紅細胞和血漿中的分布受溫度、細胞壓積、藥物濃度等多種因素影響。因此，必須采用全血樣品進行測定，以保證測定結果準確、穩(wěn)定。本試驗建立了液液萃取處理血樣和HPLC測定全血中CsA濃度的方法，采用重蒸乙醚作為萃取劑，減少了雜質的干擾。用NaOH溶液作為堿化劑，不僅可使與紅細胞結合的CsA因溶血而易于提取入醚層，同時可使一些溶于堿液的雜質留在水相，但NaOH體積不可過大，否則水相比例過高，CsA提取回收率會降低。根據CsA微溶于正己烷的性質，采用正己烷洗滌來去除脂溶性雜質的干擾。正己烷在使用前應用乙腈預飽和，有利于分層，減少CsA的損失。此方法專屬性強，靈敏度高，重現(xiàn)性好，且成本較低。

本研究發(fā)現(xiàn)，TDx法測的患者CsA全血藥物濃度明顯高于HPLC法測定結果(25.44％)(P<0.01)。將兩種分析方法測定的結果進行相關性檢驗，結果表明兩種方法測定CsA全血藥物濃度相關性較好，與文獻報道的結果一致[4,5]。用TDx和HPLC兩種方法測定標準全血樣品中CsA的濃度結果顯示，HPLC法測定結果與實際值較接近(RE<3％)，TDx法測定結果偏離實際值較大(RE>7.5％)。低、中、高三個濃度測定結果均高于HPLC測定結果，低濃度時兩種方法測定結果無明顯差異，中、高濃度時兩種方法測定結果差異顯著，而測定患者血樣時，TDx法測定結果比HPLC法測定結果高出25.44％。由此可知，TDx法測定結果，不只受CsA體內代謝產物及與藥物交叉反應的影響，還可能存在其他的影響因素。 HPLC法提取、反復萃取的步驟較多，加上對紅細胞的破壞，也可能是TDx法測定結果高于HPLC法的原因。

用HPLC法測定CsA血藥濃度相對復雜費時，但成本較TDx法低。患者樣品量少時，HPLC法可以作為測定CsA 的血藥濃度的一個科學、準確、經濟的測定方法，只是參考值比TDx偏低。樣品量大時用TDx法測定CsA血藥濃度較方便、省時。

小結：CsA各種檢測方法所得結果存在很大差別，臨床醫(yī)師在分析CsA濃度結果時應該注意其檢測方法，各實驗室在報告檢查結果時也應注明所用檢測方法，以便臨床醫(yī)師對結果進行綜合分析，準確調整患者用藥劑量，使腎移植受者應用CsA劑量更為合理，以降低毒性反應和排斥反應。

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