劉翠霞，林恭華，蘇建平，陳生云，張同作

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海 西寧 81008； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所,甘肅 蘭州 730000)

鞘翅目是昆蟲(chóng)綱中最大的類(lèi)群，在全球范圍內(nèi)都有分布，目前已知有36萬(wàn)多種，是昆蟲(chóng)綱及動(dòng)物界種類(lèi)最多、分布最廣的第一大目[1]。傳統(tǒng)的鞘翅目分類(lèi)主要依據(jù)成蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分類(lèi)。然而，相近種類(lèi)鞘翅目昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)(包括卵、蛹)形態(tài)特征非常相似，有些特征在不同的發(fā)育時(shí)期不穩(wěn)定，根據(jù)非成蟲(chóng)態(tài)的蟲(chóng)體形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行種類(lèi)鑒定非常困難，對(duì)于樣本碎片和殘缺個(gè)體更是無(wú)計(jì)可施。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起和高速發(fā)展，特別是PCR技術(shù)的日趨完善，DNA條形碼(DNA Barcoding)技術(shù)作為新的物種分類(lèi)方法和手段極大地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)的缺陷，并以其高速、快捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)成為廣大生物分類(lèi)學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)[2-8]。

DNA條形碼是一種利用短鏈DNA片段，對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)。細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(Cytochrome Oxidase Ⅰ,COⅠ)，由于相對(duì)容易擴(kuò)增，較少發(fā)現(xiàn)插入、缺失現(xiàn)象，變異速率在種內(nèi)相對(duì)較小，在種間有相對(duì)較大變異速率等優(yōu)勢(shì)[2]，已成為當(dāng)前DNA條形碼在動(dòng)物界的主要分子標(biāo)記。許多基于COⅠ作為DNA條形碼分子標(biāo)記的研究都顯示了其在物種鑒定方面的巨大作用[9-12]。

DNA條形碼技術(shù)在昆蟲(chóng)分子鑒定中應(yīng)用較多，并以鱗翅目研究最為廣泛。Hebert等[2]應(yīng)用COⅠ基因成功鑒定出200多個(gè)鱗翅目物種。Hajibabaei等[13]應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)多種熱帶鱗翅目昆蟲(chóng)進(jìn)行了準(zhǔn)確識(shí)別。Monaghan等[14]應(yīng)用DNA序列在馬達(dá)加斯加熱帶水生甲蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)幾個(gè)隱存種。但是，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)用DNA條形碼技術(shù)鑒定鞘翅目昆蟲(chóng)的研究。因此，本研究以線粒體COⅠ基因?yàn)闃?biāo)記，利用DNA條形碼技術(shù)首次對(duì)疏勒河上游及青海湖北岸常見(jiàn)鞘翅目幼蟲(chóng)進(jìn)行種類(lèi)鑒定，以探討DNA條形碼技術(shù)及COⅠ基因在鞘翅目昆蟲(chóng)分類(lèi)鑒定中的可行性及準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 試驗(yàn)樣品于2010 年7-8月采自疏勒河上游及青海湖北岸地區(qū)，置于無(wú)水乙醇中保存。根據(jù)形態(tài)特征選取20只鞘翅目幼蟲(chóng)作為DNA樣本提取材料。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取 取整只幼蟲(chóng)為材料提取基因組DNA，用蒸餾水浸泡直至幼蟲(chóng)中的酒精去凈。加入700 μL細(xì)胞裂解液、4 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)及2 μL RNase A(10 mg·mL-1)進(jìn)行消化，55 ℃恒溫作用直至消化完全。苯酚、氯仿/異戊醇 (24∶1)抽提，800 μL無(wú)水乙醇沉淀，產(chǎn)物以300 dd H2O溶解，用10 ms·mL-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并估計(jì)濃度，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴(kuò)增與測(cè)序 以20只鞘翅目幼蟲(chóng)的總DNA為模板，用引物擴(kuò)增COⅠ基因的部分序列(約830 bp)。引物由上海生物工程公司(Sangon) 合成，序列是,引物1：5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′；引物2：5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′。

PCR 擴(kuò)增在ABIVeritiTM 1000型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體積為25 μL，其中dd H2O 18.7 μL、10×PCR Reaction Buffer 2.5 μL、dNTPs(2.5 mmol·L-1) 1.2 μL(Takala)、Jerry 1.0 μL(10 μmol·L-1)、 Pat 1.0 μL(10 μmol·L-1)、Taq 酶0.2 μL(5 U·μL-1，Takala)、DNA模板 0.4 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物上樣至1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。檢測(cè)以Markers (Takala DL2000)作為分子量標(biāo)記。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3序列分析 應(yīng)用Chromas軟件對(duì)測(cè)序原始結(jié)果進(jìn)行人工校對(duì)，去掉兩端不整齊的序列，利用MEGA 4.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，同源排序，并在GenBank中應(yīng)用Blast搜索下載相似科COⅠ序列。利用MEGA 4.0對(duì)得到的20條幼蟲(chóng)序列和相似性搜索下載的鞘翅目COⅠ序列用Kimura雙參數(shù)遺傳距離法計(jì)算遺傳距離，基于遺傳距離用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，用Bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)樹(shù)各分支置信度，1 000次循環(huán)，檢查序列鑒定的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1Blast相似性搜索結(jié)果 在GenBank中用Blast搜索相似的基因序列，對(duì)比片段信息的可靠性，初步判定這20個(gè)樣本的科，亞科和屬。其中，15號(hào)鑒定至科，8、12和16號(hào)鑒定至屬，其余的鑒定至亞科。1、2、10、13和18號(hào)屬于金龜子科(Scarabaeidae)，其中，1、2號(hào)分別屬于花金龜亞科(Cetoniinae)的不同屬，10、13和18號(hào)屬于鰓金龜亞科(Melolonthinae)；8號(hào)屬于擬步甲科(Tenbrionidae)的Nyctoporis屬；12、16號(hào)屬于擬步甲科的Dailognatha屬；15號(hào)屬于天牛科(Cerambycidae)；3、4、6、14和20號(hào)屬于步甲科(Carabidae)；5、7、11、19號(hào)屬于象甲科(Curculionidae)的Molytinae亞科，9、17號(hào)屬于象甲科的Curculioninae亞科。

2.2遺傳距離分析 Raupach等[15]對(duì)歐洲344個(gè)步甲科物種基于COⅠ基因序列用K2P法計(jì)算了種內(nèi)和種間遺傳距離，結(jié)果顯示，同科的平均種間距離為0.126，并且最大距離不大于0.2，而同屬的種間距離為0～0.005。鄭福山等[16]基于COⅠ基因用K2P法對(duì)葉甲科小螢葉甲屬10種昆蟲(chóng)進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，結(jié)果顯示，葉甲科的種間遺傳距離介于0.169～0.198，而同屬的種間遺傳距離介于0.001～0.134，種間距離與Raupach得出的范圍較為一致。

由本研究測(cè)得的20條鞘翅目幼蟲(chóng)COⅠ序列與相似性搜索下載的7條鞘翅目COⅠ序列用雙參數(shù)法計(jì)算所得遺傳距離可知(表1)，1、2、10、13和18 號(hào)與金龜子科的遺傳距離介于0.160～0.164，與其他科種間的遺傳距離均大于0.2，參考Raupach等[15]和鄭福山等[16]的同科平均種間距離小于0.2的標(biāo)準(zhǔn)，可判定這幾個(gè)鞘翅目幼蟲(chóng)屬于金龜子科。以此類(lèi)推，12和16號(hào)屬于擬步甲科的Dailognatha屬，8號(hào)屬于擬步甲科的Nyctoporis屬，15號(hào)屬于天牛科，5、7、9、11、17和19號(hào)屬于象甲科，3、4、6、14和20號(hào)屬于步甲科。7、9、11、17號(hào)與象甲科的兩個(gè)亞科的遺傳距離都介于0.138～0.197，說(shuō)明象甲科的這兩個(gè)亞科親緣關(guān)系較近，由遺傳距離可推斷9、17號(hào)屬于象甲亞科(Curculioninae)，而5、7、11、19號(hào)屬于象甲科的Molytinae亞科。

2.3基于COⅠ條碼序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù) 20個(gè)鞘翅目幼蟲(chóng)COⅠ基因序列和7條從GenBank下載的鞘翅目5個(gè)科的COⅠ (566 bp)(其中象甲科和擬步甲科各有兩個(gè)亞科)基因部分序列數(shù)據(jù)通過(guò)NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。此NJ樹(shù)具有很高的置信度(圖1)，20個(gè)鞘翅目幼蟲(chóng)分為5支，其中1、2、10、13、18號(hào)與金龜子科聚為一支；8、12、16號(hào)與擬步甲科聚為一支，就科內(nèi)種間關(guān)系來(lái)看，8號(hào)優(yōu)先與擬步甲科的Nyctoporis相聚，而12、16號(hào)優(yōu)先與擬步甲科的Dailognatha相聚；3、4、6、14、20號(hào)與步甲科聚為一支 ；15號(hào)與天牛科聚為一支；5、7、9、11、17、19號(hào)與象甲科聚為一支，就科內(nèi)種間關(guān)系來(lái)看，9和17號(hào)與象甲科的Curculioninae亞科優(yōu)先相聚，5、7、11、19號(hào)與象甲科的Molytinae亞科優(yōu)先相聚。

圖1 NJ法構(gòu)建的鞘翅目幼蟲(chóng)分子系統(tǒng)樹(shù)Fig.1 Molecular phylogenetic tree of Coleoptera constructed by NJ method

3 討論

DNA條形碼開(kāi)啟了物種分類(lèi)鑒定的新時(shí)代，其顯著特點(diǎn)是可以及時(shí)快速獲得分子數(shù)據(jù)，極大地簡(jiǎn)化物種分類(lèi)和鑒定工作。mtDNA上COⅠ序列條形碼被廣泛應(yīng)用于物種分類(lèi)研究。利用DNA條形碼進(jìn)行分類(lèi)和鑒定，能夠發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分的新種和隱存種。在昆蟲(chóng)分類(lèi)鑒定方面，運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行種類(lèi)鑒定和新種發(fā)現(xiàn)研究工作在鱗翅目[17]、等翅目[18]、鞘翅目[19]及雙翅目[20]中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，特別是鱗翅目研究中應(yīng)用最為普遍。 Hebert等[21]選取COⅠ基因的一段序列對(duì)鱗翅目200多個(gè)種進(jìn)行了種類(lèi)鑒定，結(jié)果表明，該特定片段可以100%成功地鑒定每個(gè)個(gè)體。迄今為止，尚未見(jiàn)COⅠ序列條形碼用于鞘翅目幼蟲(chóng)的分類(lèi)研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)鞘翅目幼蟲(chóng)mtDNACOⅠ中566 bp的基因序列進(jìn)行分析，利用GenBank基因序列信息，運(yùn)用Blast相似性搜索，用雙參數(shù)法計(jì)算遺傳距離，并以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，鑒定出20個(gè)未知鞘翅目幼蟲(chóng)分別屬于5科9屬。3個(gè)分析方法所得結(jié)果基本一致，表明應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)η食崮坑紫x(chóng)進(jìn)行分類(lèi)鑒定，mtDNACOⅠ基因用于鞘翅目幼蟲(chóng)分類(lèi)鑒定具有可行性、方便性和快捷性。NJ無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果進(jìn)一步表明試驗(yàn)鞘翅目幼蟲(chóng)中科之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，容易區(qū)分。在科內(nèi)屬的水平，象甲科的Curculioninae屬和Molytinae屬，擬步甲科的Dailognatha屬和Nyctoporis屬也能夠明確區(qū)分。

經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)得到了很多的支持，用DNA條形碼對(duì)物種進(jìn)行鑒定研究越來(lái)越普遍，而作為能夠用作條形編碼的基因，一是必須具有相對(duì)的保守性，便于用通用引物擴(kuò)增；二是必須具備足夠的變異能將物種鑒別。本研究中采用COⅠ基因不僅能擴(kuò)增出鞘翅目的幼蟲(chóng)，甚至能將最初錯(cuò)誤判定為鞘翅目的雙翅目和膜翅目幼蟲(chóng)的序列擴(kuò)增出來(lái)，說(shuō)明此基因在昆蟲(chóng)中具有一定的保守性，而通過(guò)遺傳距離等分析，也表明mtDNA上COⅠ部分序列具有足夠的變異，能有效地對(duì)鞘翅目幼蟲(chóng)進(jìn)行科屬鑒定。

由于該方法快速、簡(jiǎn)便和精確，有助于對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的幼蟲(chóng)、卵和蛹進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒定，解決了鞘翅目幼蟲(chóng)、卵和蛹鑒定的一大難題。但是，對(duì)COⅠ中部分基因序列進(jìn)行分析，雖然可以較精確地鑒定這20個(gè)鞘翅目幼蟲(chóng)的科、屬，但對(duì)個(gè)別屬間親緣關(guān)系較近的個(gè)體(如金龜子科的各屬之間)則很難鑒別，必須依靠多個(gè)基因片段來(lái)共同鑒定，這正是未來(lái)DNA條形碼技術(shù)的重要發(fā)展方向。此外，DNA條形碼技術(shù)用基因差異計(jì)算出的遺傳距離，目前都缺少精細(xì)的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，采用通用的遺傳距離范圍不太可能解決所有的物種鑒定問(wèn)題，應(yīng)該在不同的目、科甚至屬之間選用不同的標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離范圍，這樣才能夠更加精確地對(duì)不同物種進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

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