蔣新民，楊春華，劉 羽

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安 625014)

草地早熟禾(Poapratensis)是典型的禾本科冷季型多年生草本植物，為重要的草坪草之一。隨著人們對(duì)高品質(zhì)草坪的需求增加，為保持草地早熟禾在現(xiàn)代草坪園藝市場(chǎng)中的重要地位，必須對(duì)其不良性狀進(jìn)行改良，如草地早熟禾的抗除草劑、抗蟲(chóng)能力弱，適應(yīng)性、耐陰性和耐鹽堿性等能力差。但由于草地早熟禾具有兼性無(wú)融合生殖的特性[1]，采用常規(guī)育種技術(shù)改良這些不利性狀難度大，而任何遺傳轉(zhuǎn)化能否成功必須依賴(lài)于能否通過(guò)組織培養(yǎng)獲得改良性狀的再生植株[2]。國(guó)外早在20世紀(jì)80年代就開(kāi)始了對(duì)早熟禾的組織培養(yǎng)研究[3]。在過(guò)去30余年中，有大量關(guān)于草地早熟禾外植體取材的探索，主要為植株、成熟種子、未成熟的合子胚[4-5]、未成熟的花序[6]、莖尖[7]、成熟種子[6,8]、胚芽鞘、葉片以及苗莖段等[9]。國(guó)內(nèi)學(xué)者也對(duì)草地早熟禾愈傷組織外植體的選擇做了大量研究，信金娜等[10]對(duì)草地早熟禾成熟種子和胚軸進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)成熟種子的出愈率和胚性愈傷誘導(dǎo)率均高于胚軸；皮偉等[11]試驗(yàn)表明，早熟禾幼胚軸誘導(dǎo)愈傷組織很容易，再生苗獲取困難。未成熟花也是外植體的最佳選材，但取材受季節(jié)限制[12]，在實(shí)際組織培養(yǎng)中操作難度大。成熟種子同其它外植體相比，其愈傷組織的芽分化頻率較低，但易于獲取，且不受季節(jié)和植株發(fā)育時(shí)期等因素的限制，具備取材方便、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[13]。因此，成熟種子作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)建立一個(gè)高頻的植株再生體系成為大多研究者的首選。

為建立一個(gè)高效的草地早熟禾品種“ABBY”遺傳轉(zhuǎn)化受體體系，需要對(duì)組織培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選、優(yōu)化，為該品種在國(guó)內(nèi)引種、馴化和改良提供基礎(chǔ)。因此，本研究選用草地早熟禾品種“ABBY”的成熟種子為外植體，對(duì)該品種愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行探索，以期為建立一個(gè)高頻的該品種遺傳轉(zhuǎn)化再生體系打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 試驗(yàn)材料以由美國(guó)密西根州立大學(xué)提供的草地早熟禾“ABBY”品種的成熟種子為外植體。

1.1.2植物激素 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，6-BA(6-芐基氨基嘌呤)，NAA(萘乙酸)。2,4-D和NAA分別用少量無(wú)水乙醇溶解后，加蒸餾水配成1 mg·L-1的母液；6-BA用少量10% NaOH溶解后，加蒸餾水配成1 mg·L-1的母液。于4 ℃冰箱保存。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基配置 培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+7 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加不同濃度激素。培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8，在121～126 ℃下滅菌20 min備用。

1.2.2外植體的處理 將包被于“ABBY”穎果上的內(nèi)外稃去除，自來(lái)水沖洗后置于4 ℃冰箱內(nèi)浸泡12 h后備用。接種前，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精對(duì)預(yù)處理的種子表面消毒10 min，消毒后用滅菌去離子水清洗3次；然后加入適量0.1% HgCl并搖勻攪拌8 min，再用滅菌去離子水清洗5次。

1.2.3愈傷組織誘導(dǎo) 在超凈工作臺(tái)上，用槍狀鑷將已滅菌的種子接種于培養(yǎng)基上。每個(gè)培養(yǎng)皿接種50粒種子，每個(gè)處理重復(fù)5次(表1、表2)。愈傷組織誘導(dǎo)在(25±2)℃黑暗條件下培養(yǎng)，每10 d觀察記錄各處理愈傷組織的出愈率和生長(zhǎng)情況。

1.2.4愈傷組織分化 在培養(yǎng)基中加入不同濃度的NAA和6-BA(表3)。選取愈傷組織淡黃色、表面干燥而緊實(shí)、體積較大的愈傷組織塊，接種于培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基分別接種15瓶，每瓶接種2～3塊。置于27 ℃、光照16 h·d-1、光照強(qiáng)度10 000 lx，及溫度25 ℃、黑暗8 h·d-1環(huán)境中變溫培養(yǎng)。4周后統(tǒng)計(jì)“ABBY”分化率。

1.2.5數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0軟件包和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法對(duì)處理間平均數(shù)進(jìn)行方差分析，P<0.05 為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1不同激素濃度配比對(duì)草地早熟禾愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.1不同濃度2,4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 在培養(yǎng)基中加入不同濃度2,4-D，經(jīng)30 d黑暗培養(yǎng)后表明，不同濃度的2,4-D對(duì)草地早熟禾“ABBY”誘導(dǎo)率及愈傷組織的質(zhì)量都有顯著影響(表1、圖1)。

2,4-D對(duì)愈傷組織出愈率具有顯著影響(表1，P<0.05)。當(dāng)2,4-D濃度為3 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高。當(dāng)添加2,4-D濃度在3 mg·L-1以下時(shí)，隨著添加濃度增加，愈傷組織誘導(dǎo)率增加。當(dāng)添加2,4-D濃度在3 mg·L-1以上時(shí)，隨著添加濃度增加，愈傷組織誘導(dǎo)率降低。

表1 2, 4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of 2, 4-D on callus induction

2.1.22,4-D和6-BA不同濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的2,4-D和6-BA,經(jīng)30 d黑暗培養(yǎng)后，“ABBY”的出愈率和愈傷組織品質(zhì)不同,2,4-D和6-BA兩個(gè)因素對(duì)“ABBY”愈傷組織誘導(dǎo)率均具有顯著影響(表2)。MS+1 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA 的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高(表2)，為54.74%；其次為MS+1 mg·L-12,4-D+0.4 mg·L-16-BA ，其誘導(dǎo)率為45.81%。且在所有處理中，MS+mg·L-12,4-D 1+0.4 mg·L-16-BA的愈傷組織生長(zhǎng)速度和愈傷組織品質(zhì)最好。

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2,4-D濃度為1 mg·L-1時(shí)，不同濃度的6-BA的誘導(dǎo)率均值為44.84%，明顯大于2,4-D其它濃度與不同濃度的6-BA共同作用的誘導(dǎo)率(表2)。

綜上所述，與單獨(dú)使用2,4-D(誘導(dǎo)率最高為38.09%)相比，2,4-D與6-BA配合使用，處理MS+1 mg·L-12,4-D+0.4 mg·L-16-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率較高且質(zhì)量較好。

2.2不同激素濃度處理對(duì)草地早熟禾愈傷組織分化的影響 不同濃度的NAA和6-BA對(duì)“ABBY”分化率有顯著影響(表3)。當(dāng)NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，不同濃度的6-BA對(duì)胚性愈傷組織分化率影響差異顯著(P<0.05)，分化率隨6-BA濃度的增加而增大。當(dāng)6-BA濃度在3 mg·L-1以下時(shí)，愈傷組織分化率隨濃度的增加而增大。當(dāng)6-BA濃度為3 mg·L-1時(shí)，分化率達(dá)到100%?？梢?jiàn)，在MS培養(yǎng)基中添加0.2 mg·L-1NAA和3 mg·L-16-BA最適愈傷組織分化(表3)。

表2 2,4-D和6-BA不同質(zhì)量濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different concentrations of 2,4-D and 6-BA on callus induction

圖1 草地早熟禾(ABBY)組織培養(yǎng)各個(gè)階段Fig.1 Different tissue culture stages of Kentucky bluegrass (ABBY)

表3 不同濃度NAA和6-BA對(duì)胚性愈傷組織分化的影響Table 3 Effects of different concentrations of NAA and 6-BA on embryogenic callus differentiation

3 討論

3.1不同外源激素對(duì)草地早熟禾胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化是草地早熟禾植株再生體系的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在禾本科植物愈傷組織的誘導(dǎo)中，2,4-D是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，起著決定性作用，其通過(guò)對(duì)內(nèi)源生長(zhǎng)素水平的調(diào)整和平衡來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞分裂和胚性潛力的誘導(dǎo)，并促進(jìn)體細(xì)胞胚的早期發(fā)育[14]。

本研究表明，單獨(dú)使用2,4-D時(shí)，當(dāng)濃度在1～3 mg·L-1時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率隨濃度的增加而增大；當(dāng)濃度超過(guò)3 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨濃度的增加而降低。因此，草地早熟禾“ABBY”組織培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)的2,4-D最適濃度為3 mg·L-1。這個(gè)結(jié)論與馬忠華等[3]的試驗(yàn)一致，即在一定濃度范圍內(nèi)，誘導(dǎo)率隨2,4-D濃度的增加而增加，但過(guò)高或過(guò)低濃度的2,4-D都會(huì)使愈傷組織的誘導(dǎo)率降低[15]。除此之外，一定量的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素能夠提高愈傷組織的品質(zhì)，但所需濃度尚需研究。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用2,4-D(誘導(dǎo)率最高為38.09%)相比，2,4-D與6-BA配合使用誘導(dǎo)率更高，且愈傷組織質(zhì)量更好。由此說(shuō)明，添加6-BA可以提高草地早熟禾的愈傷組織誘導(dǎo)率，與丁路明等[16]的研究結(jié)論一致，但2,4-D與6-BA的配合使用中獲得最高出愈率的2,4-D濃度與單獨(dú)使用2,4-D時(shí)的最適濃度不一致。當(dāng)2,4-D濃度為3 mg·L-1時(shí)，不同濃度6-BA的誘導(dǎo)出愈率顯著低于2,4-D濃度為1 mg·L-1時(shí)不同濃度6-BA的誘導(dǎo)出愈率?？赡苁?-BA與2,4-D共同調(diào)節(jié)著草地早熟禾“ABBY”某種植物內(nèi)源激素或蛋白質(zhì)，從而使得其效果相互疊加，引起在2,4-D與6-BA的配合使用中2,4-D濃度的下降，具體是哪種植物內(nèi)源激素，還需進(jìn)一步研究探索。

3.2不同外源激素對(duì)草地早熟禾愈傷組織分化的影響 在愈傷組織分化過(guò)程中，6-BA是重要的激素之一，對(duì)根和芽的分化具有明顯的促進(jìn)作用。2,4-D作為一種生長(zhǎng)素，主要作用是促進(jìn)去分化，而不利于細(xì)胞再分化，因而在分化培養(yǎng)基中不添加或添加較低濃度2,4-D。本試驗(yàn)中在分化培養(yǎng)基中加入NAA 與6-BA兩種外源激素，NAA的最適濃度為0.2 mg·L-1，且愈傷組織分化率隨6-BA濃度的增加而增大。當(dāng)NAA 濃度為0.2 mg·L-1、6-BA的濃度為3 mg·L-1時(shí)，愈傷組織分化率達(dá)到最高。馬忠華等[3]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分化培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度的2,4-D對(duì)愈傷組織分化形成幼苗有顯著影響，0.1 mg·L-1的2,4-D 誘導(dǎo)分化率最高。丁路明等[17]試驗(yàn)也表明，0.1 mg·L-1的2,4-D是誘導(dǎo)肯塔基草地早熟禾愈傷組織分化的最佳濃度；NAA和6-BA配合使用不如單獨(dú)使用2,4-D誘導(dǎo)分化效果好。然而皮偉等[11]報(bào)道在添加0.1、0.3 mg·L-12,4-D的分化培養(yǎng)基上不能長(zhǎng)成幼苗，2,4-D的存在抑制了幼芽的生長(zhǎng)。綜上所述，草地早熟禾品種不同，結(jié)論差異甚大。因此，草地早熟禾愈傷組織分化選用激素配比因品種而異。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用2,4-D時(shí)，“ABBY”組織培養(yǎng)的2,4-D最適濃度為3 mg·L-1。當(dāng)2,4-D與6-BA的配合使用時(shí)，處理MS+1.0 mg·L-12,4-D+0.4 mg·L-16-BA的胚性愈傷組織出愈率為45.81%，且愈傷組織質(zhì)量最好。因此，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中，處理MS+1 mg·L-12,4-D+0.4 mg·L-16-BA為草地早熟禾“ABBY”的最適試驗(yàn)配方。在分化培養(yǎng)中，處理MS+0.2 mg·L-1NAA +3 mg·L-16-BA為草地早熟禾“ABBY”最適的試驗(yàn)配方。

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