張 麗，周長征

(山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

木芙蓉葉為錦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥葉，其味微辛，性涼，歸肺、肝經(jīng)，具有清肺涼血、散熱解毒、消腫排膿等功效，臨床主要用于肺熱咳嗽、瘰疬等的治療[1]。本實驗通過體外建立細胞感染模型試驗和體內(nèi)感染小鼠試驗來驗證木芙蓉葉提取物具有抗病毒的藥理活性，以期為木芙蓉葉能開發(fā)成一種防治病毒的新藥提供藥效學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥物 木芙蓉HibiscusmutabilisL.葉購于安徽濠州藥材市場，由周鳳琴教授鑒定。陽性對照藥利巴韋林針劑(100mg/mL，山東魯抗醫(yī)藥集團有限公司)。

1.2 病毒 呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(Flu A)和副流感病毒(HPIVs)均引自中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所。

1.3 細胞 HEK-293細胞(人胚胎腎細胞系)購自美國Clontech公司。

1.4 試劑 MEN培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；新生小牛血清(杭州四季青公司)；胰酶(美國Gibco公司)；細胞維持液(含2%新生牛血清的MEN)；細胞培養(yǎng)液(含10%新生小牛血清的MEN)；其他試劑均為分析純。

1.5 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Forma公司)；-80 ℃冰箱(美國Forma公司)；-20 ℃冰箱(中國青島得貝公司產(chǎn)品)；酶標儀(芬蘭Labsystems公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；高速離心機(德國Heraeus公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國上海鑫培儀器設備有限公司)。

1.6 動物 昆明種鼠，雄性，體質(zhì)量13～14 g，潔凈級，引自山東大學動物中心。

2 實驗方法

2.1 提取物的制備 木芙蓉葉煎煮3 h，水提液減壓濃縮至稠浸膏，加入乙醇進行醇沉,過濾得到沉淀，沉淀用蒸餾水溶解。用D101型大孔吸附樹脂進行洗脫得到25%乙醇洗脫液,濃縮洗脫液，使其生藥含量為0.5 g/mL，藥液過0.2 μm孔徑濾膜除菌，備用。

2.2 體外抗病毒試驗

2.2.1 藥物細胞毒性測定 將HEK-293細胞懸液接種于96孔板中,使其長成單層細胞。用細胞維持液以2倍比稀釋陽性對照藥品利巴韋林和木芙蓉葉提取物，每孔100 μL，每個稀釋度縱向設立3個復孔，平行方向設2行正常細胞對照。將96孔板置37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日用顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)和形態(tài)的變化，連續(xù)觀察5 d，染色，使用酶標儀在540 nm處測定各孔光吸收值，利用Reed-Mucnch法計算藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)[2]。

2.2.2 藥物的抑毒作用 將細胞懸液接種于96孔板中，使其長成單層細胞,倒掉培養(yǎng)液，將待測藥液按2倍比稀釋順序橫向接種在各孔中,每孔100 μL藥液，然后接種100TCID50的不同病毒液50 μL，每種病毒橫向接種1行,縱向設置3個復孔，每塊96孔板均設置利巴韋林陽性藥品對照，病毒對照，正常細胞對照以及空白對照(無細胞生長)。置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,每日觀察細胞生長狀態(tài)和形態(tài)，以細胞病變效應(CPE)為指標，以病毒對照出現(xiàn)4級CPE為終點，染色，使用酶標儀在540 nm處測定各孔光吸收值，計算細胞存活率，利用Reed-Mucnch法計算半數(shù)有效濃度(EC50),得到治療指數(shù)TI=(TC50/EC50)，治療指數(shù)越大表示藥物作用越強。細胞病變效應(CPE)劃分級別[3]：0級細胞無病變出現(xiàn)，正常生長；1級細胞出現(xiàn)25%以下的病變；2級細胞出現(xiàn)25%～50%的病變；3級細胞出現(xiàn)50%～75%的病變；4級細胞出現(xiàn)75%以上的病變。

2.3 體內(nèi)抗病毒試驗

2.3.1 接種病毒劑量的測定 昆明種小鼠40只，將動物按體質(zhì)量隨機分為4組，每組10只，分別為：病毒大劑量組、病毒中劑量組、病毒小劑量組和正常對照組。各組動物乙醚麻醉[4]下分別鼻腔接種上述RSV毒液(效價320∶1)50、25、12.5 μL和細胞培養(yǎng)液50 μL，常規(guī)喂養(yǎng)，每日觀察動物存活情況，記錄死亡動物及時解剖，做病理學檢測。在第7天末次給藥40 min后，將動物眼動脈叢放血，牽頸臼處死，無菌取肺組織，做病理學檢測[5]。

2.3.2 藥物體內(nèi)抗病毒活性測定 將動物隨機分為正常對照組、病毒模型對照組、利巴韋林對照組和木芙蓉葉提取物大、中、小劑量治療組，每組10只。在乙醚麻醉下，正常組動物鼻腔接種細胞培養(yǎng)液25 μL，其余動物均鼻腔接種RSV毒液25 μL。藥物灌胃，每日2次，連續(xù)7 d。每日觀察動物鼻腔是否有分泌物、存活情況，在第7天末次給藥4 h后,將動物稱重后眼動脈叢取血、牽頸臼處死，無菌條件下取肺組織，稱重計算肺指數(shù)，得到肺指數(shù)抑制率[5]。(肺指數(shù)=小鼠肺重/小鼠體質(zhì)量×100%；肺指數(shù)抑制率=(病毒對照組平均肺指數(shù)-給藥組平均肺指數(shù))/病毒對照組平均肺指數(shù)×100%)

3 實驗結果

3.1 體外抗病毒試驗結果 木芙蓉葉體外抗病毒試驗結果表明木芙蓉葉提取物對3種病毒都有不同程度的抑制作用,其提取物對抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的增殖有較為顯著的作用，治療指數(shù)達到了89.08，對甲型流感病毒(Flu A)也有較好的抑制作用，但對副流感病毒(HPIVs)致細胞病變的抑制作用相對較小(見表1)。

表1 木芙蓉葉體外抗病毒試驗結果

3.2 體內(nèi)抗病毒試驗結果

3.2.1 接種病毒劑量測定的結果 與正常對照組比較，接種病毒組動物毛色暗淡,缺乏光澤。正常對照組動物無死亡；大劑量病毒組動物在造模第6天死亡3只；中、小病毒劑量組動物無死亡。大劑量組肺組織外觀出現(xiàn)明顯充血、出血斑點或花紋等癥狀,有2只動物出現(xiàn)一葉肺萎縮，有3只動物出現(xiàn)一葉肺實變；中劑量病毒組動物肺組織也可見到充血或花紋;小劑量病毒組3只動物肺組織出現(xiàn)斑點。病毒重分離大劑量病毒組有9只、中劑量8只、小劑量2只分離到病毒(見表2)?？紤]到本實驗的目的是觀察木芙蓉葉提取物防治上呼吸道感染的效果,所以決定采用25 μL病毒為造模適宜劑量。

表2 接種病毒劑量測定結果

3.2.2 藥物體內(nèi)抗病毒活性測定結果 通過統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理,病毒對照組與正常組比較肺指數(shù)有顯著差異(P<0.01)，RSV可以引起正常鼠肺指數(shù)的升高，表示造模成功；經(jīng)過藥物灌胃治療后，3組木芙蓉葉提取物給藥組，利巴韋林陽性對照組均能降低由RSV引起的小鼠肺部感染的肺指數(shù)，與病毒對照組比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05)(見表3)。試驗結果說明木芙蓉葉提取物可以抑制由RSV引起的小鼠上呼吸道感染,并且在一定的劑量范圍內(nèi)，其活性隨劑量的增大而增強。

4 討論

上呼吸道感染是臨床上的常見病，常由呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒等引起。目前治療呼吸道病毒感染的藥物主要有利巴韋林、金剛烷胺、聚肌胞等藥物[6],這些藥物的抗病毒譜相對較窄，而且這些藥物的不良反應較大，所以尋求效果顯著、不良反應小的藥物是目前研發(fā)的主要目標，所以中藥成為治療病毒性上呼吸道感染的熱門。[7-8]

表3 木芙蓉葉提取物對RSV感染小鼠肺部炎癥(肺指數(shù))的影響(±s,n=10)

通過體外抗病毒實驗證明，木芙蓉葉提取物對RSV等3種病毒均具有體外抗病毒作用，尤其是對RSV的抑制作用較強;通過體內(nèi)試驗從肺組織外觀可以觀察到肺組織的病變程度有了明顯的減輕，肺指數(shù)降低較為顯著,證明木芙蓉葉提取物在所試劑量范圍內(nèi)對RSV引起的肺部炎癥有明顯的抑制作用。所以綜合體內(nèi)、體外實驗的結果可知木芙蓉葉提取物具有較好的抗病毒作用，為治療上呼吸道病毒感染疾病提供了充分的藥理藥效學基礎。

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