楊麗珍,趙渺凡

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科,黑龍江 哈爾濱 150040)

性早熟是一種生長(zhǎng)發(fā)育異常,主要表現(xiàn)為第二性征提早出現(xiàn)。近年來(lái)隨著我國(guó)人民生活水平的提高,隨意給健康兒童進(jìn)補(bǔ)的現(xiàn)象十分普遍,據(jù)不完全隨意抽樣調(diào)查統(tǒng)計(jì),約0.67%兒童發(fā)育提前,有性早熟的趨勢(shì),約20%出現(xiàn)異常超重[1],其中以真性性早熟(亦稱(chēng)特發(fā)性中樞性性早熟ICPP)最為常見(jiàn),約占女孩性早熟的80%～90%,男孩性早熟的40%[2-3]。該癥主要由于下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)致下丘腦—垂體—性腺軸(HPGA 軸)提前發(fā)動(dòng)、功能亢進(jìn),導(dǎo)致第二性征提前出現(xiàn)、骨齡提前、骨骺過(guò)早閉合,兒童生長(zhǎng)發(fā)育主要受生長(zhǎng)激素-胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(GH-IGF-1)軸調(diào)控,而激素水平的提高導(dǎo)致性發(fā)育過(guò)早,也對(duì)患兒的心理發(fā)育產(chǎn)生不利影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)中藥梔早顆粒對(duì)性早熟SD 大鼠干預(yù)機(jī)制的研究,觀察對(duì)血清GH、IGF-I 水平的影響情況,為中醫(yī)藥治療性早熟作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SD 大鼠性早熟模型的建立

1.1.1 材料

1.1.1.1 喂養(yǎng)條件 1)選用SD 清潔級(jí)未孕大鼠,雌雄鼠20 對(duì),體質(zhì)量250～300 g(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),飼養(yǎng)于開(kāi)放系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室。2)溫度范圍19～29℃,濕度40%～80%,照明時(shí)間8:00-17:00,通風(fēng)系統(tǒng)保持室內(nèi)空氣流暢。3)每星期早上定時(shí)換2 次墊料,早上定時(shí)換水和加飼料,水為一般的自來(lái)水,普通飼料,動(dòng)物自飲自食。

1.1.1.2 藥品試劑 達(dá)那唑膠囊(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20023116)每300 μg 溶解于25 μL 乙二醇/乙醇(V∶V=1∶1)混合液中。

1.1.1.3 儀器 Nikon 熒光顯微鏡、SN-659 型智能放免測(cè)量?jī)x、AB204-E 電子分析天平、TGL-16G 臺(tái)式離心機(jī)、TIZ5-WS 多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)、灌胃針、50 μL微量注射器等。

1.1.2 方法

1.1.2.1 種鼠選擇 配種選用SD 清潔級(jí)未孕大鼠,雌雄鼠20 對(duì),體質(zhì)量250～300 g,一對(duì)一籠喂養(yǎng)交配,全價(jià)營(yíng)養(yǎng)配方飼料,自飲自食。每天早上定時(shí)查看陰栓,有陰栓的選用母鼠飼養(yǎng)于另一只塑料籠盒中,并在籠上貼上標(biāo)簽,標(biāo)簽上寫(xiě)明配種日期、陰栓日期和籠號(hào),籠號(hào)順序從1～n 開(kāi)始編號(hào)。

1.1.2.2 動(dòng)物分組 出現(xiàn)陰栓后第19 天以后每天上、下午定時(shí)查看仔鼠出生情況,若有出生則選用雌仔鼠,稱(chēng)體質(zhì)量,記錄雌鼠數(shù)量,在籠表簽上再填上出生日期。選用4 d 內(nèi)出生的雌鼠。點(diǎn)數(shù),分籠,分組,分為正常對(duì)照組(Normal-Control,NC組)、IPCC 模型組(model,M組)、GnRH-A 對(duì)照組(GnRH-A,GA組)、梔早顆粒高劑量組(ZZKL-H組)、梔早顆粒中劑量組(ZZKL-M組)、梔早顆粒低劑量組(ZZKL-L組)。每組鼠數(shù)控制在8 只以上,每籠出生鼠由親母自養(yǎng),每籠8 只,若每籠出生雌鼠數(shù)量不足8 只,則用該親母生的雄仔鼠湊足8 只,確保每籠內(nèi)飼養(yǎng)密度一致,體質(zhì)量一致,以達(dá)到飼養(yǎng)條件一致。從出生開(kāi)始每隔3 d記1 次體質(zhì)量,每天早上定時(shí)記錄,并寫(xiě)在體質(zhì)量記錄表上。

1.1.2.3 造模 用酒精棉簽消毒,用50 μL 微量注射器吸取25 μL 達(dá)那唑溶解液皮下注射。注射時(shí)防止液體溢出,若有溢出則丟棄。模型組、GnRH-A組、梔早顆粒高劑量組、梔早顆粒中劑量組、梔早顆粒低劑量組于出生最早的雌性大鼠為5日齡同1 d 每只皮下注射25 μL 達(dá)那唑溶液,正常對(duì)照組不予處理。

1.2 SD 大鼠實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1.1 抑那通 注射用醋酸亮丙瑞林(促性腺激素釋放激素類(lèi)似物制劑)。GnRH-A組以抑那通為對(duì)照藥物。抑那通針劑首劑、次劑用量均為2.5 倍臨床等效劑量,分別為1 573.5 μg/kg 和1 180 μg/kg,配制時(shí)用原配的溶液溶解,再加滅菌注射用水稀釋而成,濃度分別為157 μg/mL 和118μg/ mL。

1.2.1.2 梔早顆粒中 夏枯草、梔子、柴胡、白芍、荔枝核、牡蠣、瓜蔞、浙貝母、郁金(由江蘇江陰天江制藥有限公司制備),1 劑9 g,用溫開(kāi)水溶解。梔早顆粒高、中、低劑量組分別按生藥量5.40 g/(kg·d),2.70 g/(kg·d),1.35 g/(kg·d),分別相當(dāng)于臨床人用量的14 倍、7 倍、3.5 倍灌胃。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)給藥方法與劑量 梔早顆粒中藥組大鼠在15日齡時(shí)開(kāi)始用灌胃法喂梔早顆粒,每只每次喂飼3 mL,每天1 次,模型組給予等量的生理鹽水灌胃。GnRH-A組大鼠在15日齡時(shí)以抑那通于右后肢處肌注,隔日1 次,首次給藥劑量為1 573.5 μg/kg,次劑用量1 180 μg/kg。大鼠25日齡時(shí)開(kāi)始每天檢查陰門(mén)開(kāi)口情況,如動(dòng)物在第1 次檢查時(shí)陰門(mén)已經(jīng)開(kāi)口,則陰門(mén)開(kāi)口時(shí)間記為25 d。從大鼠陰門(mén)開(kāi)口日起,每天上午定時(shí)做陰道涂片,直至大鼠建立正常的性周期。

1.2.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)指標(biāo) 用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg,腹膜內(nèi)注射)麻醉,麻醉后,摘眼球取血3 mL,室溫凝血后,3 000 r/min,離心20 min,取血清,-20℃凍存,以備檢查血GH、IGF-I 水平。

1.2.4 采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè) IGF-1 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)。已知IGF-1 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將IGF-1 和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色,顏色的深淺和樣品中IGF-1 的濃度呈比例關(guān)系。GH 試劑盒同理。試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD 公司,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理資料,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。判斷均數(shù)差異顯著性,當(dāng)P ＜0.05時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠血清GH 、IGF-I 水平比較,見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清GH、IGF-I 水平比較()

表1 各組大鼠血清GH、IGF-I 水平比較()

注:與性早熟模型組比較,#P ＜0.05。

3 討論

正常青春發(fā)育的發(fā)動(dòng)緣于下丘腦脈沖分泌釋放促性腺激素釋放激素(GnRH)而激活垂體—性腺軸的青春發(fā)育過(guò)程。而GH-IGF-1 軸是一個(gè)對(duì)人體內(nèi)分泌代謝很重要的部分,尤其是調(diào)控青春期的生長(zhǎng)發(fā)育,且GH 的促生長(zhǎng)作用是通過(guò)肝腎等組織依賴(lài)IGF-I 來(lái)介導(dǎo)的,IGF-I 直接作用于靶細(xì)胞又對(duì)GH 的分泌有著反饋抑制作用。近年來(lái)的很多研究[4-9]表明,生長(zhǎng)激素(GH)、瘦素(Leptin)、甲狀腺素等很多激素均可對(duì)性腺軸產(chǎn)生影響,且發(fā)現(xiàn)IGF-I 是聯(lián)系營(yíng)養(yǎng)和生殖的紐帶,是青春發(fā)動(dòng)的重要信號(hào)之一。性腺軸和促生長(zhǎng)軸在青春期生長(zhǎng)中有不可分割的有機(jī)聯(lián)系。青春期的身高突增有賴(lài)于兩者的協(xié)調(diào)調(diào)控。如果能明確GH-IGF-I 軸的作用機(jī)制將對(duì)于指導(dǎo)我們?cè)谂R床上相關(guān)的疾病診療用藥方面有很高的現(xiàn)實(shí)意義。

根據(jù)[10]哈爾濱地區(qū)性早熟女童發(fā)病因素的調(diào)查及與中醫(yī)辨證分型的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)哈爾濱市性早熟女童以肝郁化火痰結(jié)型為主,治療應(yīng)以疏肝、清肝、化痰軟堅(jiān)法為主,同時(shí)依據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)中醫(yī)女子以肝為先天的理論,結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn),應(yīng)用純中藥制劑梔早顆粒于臨床治療性早熟多年,效果顯著。本實(shí)驗(yàn)也為進(jìn)一步闡明應(yīng)用梔早顆粒不同劑量來(lái)干預(yù)性早熟模型大鼠血清GH、IGF-I 的水平機(jī)理,從而證實(shí)了梔早顆粒高、中組劑量能有效抑制血清GH、IGF-I 的濃度。因此我們可以認(rèn)為降低GH、IGF-I 的血清水平是梔早顆粒可以有效的減緩第二性征的提前出現(xiàn),減慢骨齡增長(zhǎng)骨骺愈合速度的作用機(jī)制之一。或許在其他方面也可以進(jìn)一步探討梔早顆粒能夠抑制青春期過(guò)早啟動(dòng),比如明確大鼠下丘腦Leptin 受體,肝臟IGF-ImRNA 表達(dá)情況等方面,這些都與性早熟密切相關(guān),值得我們?nèi)蘸蟾由钊氲难芯?用更多現(xiàn)代科研手段尋找治療性早熟作用的靶點(diǎn)[11-12]。

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