沈楠趙永波黃東雅

·論 著·

帕金森病大鼠CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化☆

沈楠*趙永波△黃東雅*

目的研究帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）大鼠外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的改變，并探討其與腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。方法SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、PD 4周組、PD 2周組。PD 4周組和2周組定向注射6-羥多巴建立PD大鼠模型，假手術(shù)組注射PBS緩沖液，PD 2周組于術(shù)后第2周，其他組于術(shù)后第4周時(shí)，應(yīng)用免疫熒光染色法觀察各組大鼠黑質(zhì)處酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）陽(yáng)性神經(jīng)元、離子鈣接頭蛋白分子-1（Ionized calcium bindingadaptor molecule-1，iba-1）和膠原纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acid protein，GFAP）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)的改變，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)其外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴細(xì)胞比例的變化。結(jié)果PD4周組TH陽(yáng)性神經(jīng)元偏側(cè)毀損率（91.33%±8.53%）較對(duì)照組和假手術(shù)組增加（P＜0.01），且較PD2周組（64.56%±17.94%）毀損更為嚴(yán)重（P＜0.05）。PD4周組iba-1陽(yáng)性細(xì)胞增加率（82.60%±11.52%）和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加率（86.62%±6.80%）較對(duì)照組及假手術(shù)組均增加（P＜0.01），但PD 4周組較2周組iba-1陽(yáng)性細(xì)胞增加率（104.89%±13.39%）和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加率（117.92%±15.34%）均減少（P＜0.05）。FCM示PD4周組大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴細(xì)胞的比例（0.64%±0.08%）較對(duì)照組、假手術(shù)組及PD2周組均降低（P＜0.01）。另外，外周血T淋巴細(xì)胞中Treg比例變化與TH陽(yáng)性神經(jīng)元?dú)p率（r=-0.59，P＜0.01）、iba-1陽(yáng)性細(xì)胞增加率（r=-0.87，P＜0.01）和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加率（r=-0.89，P＜0.01）均呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論P(yáng)D大鼠外周血中Treg比例減少且可能與腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)。

CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 星形膠質(zhì)細(xì)胞 小膠質(zhì)細(xì)胞 帕金森病

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，現(xiàn)已有研究證實(shí)免疫因素在其中發(fā)揮重要作用，如外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）減少易引起PD或加重PD程度[1]，但是目前尚無(wú)研究表明PD疾病本身是否反之也會(huì)影響外周免疫功能。故本研究擬通過(guò)檢測(cè)不同病期PD大鼠外周血中Treg，觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況，初步了解PD是否會(huì)引起Treg的改變，并研究這種變化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)間的相關(guān)性，以期為PD的早期診斷、早期治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制備健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～270 g（同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、PD 4周組、PD 2周組,每組8只。

10%水合氯醛麻醉PD 4周組和PD 2周組大鼠后，固定于大鼠腦立體定位儀上（美國(guó)ASI公司），參照Paxinos《The Rat Brain》圖譜，選取右側(cè)黑質(zhì)致密部（坐標(biāo)：前囟后5.3 mm，中縫旁開(kāi)2.0 mm，硬膜下7.7 mm）和前腦內(nèi)側(cè)束（坐標(biāo)：前囟后3.5 mm，中縫旁開(kāi)2.0 mm，硬膜下8.6 mm）兩點(diǎn)為注射位點(diǎn)，每點(diǎn)注射3μL濃度為2μg/μL的6-羥多巴（6-hydmxydopamine，6-OHDA，美國(guó)sigma公司），注射速度為1 μL/min，留針10 min后退針。PD 4周組和PD 2周組大鼠分別于術(shù)后第4周及第2周組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組在同部位注射等體積的PBS緩沖液，并于術(shù)后第4周進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)，不注射任何試劑，與假手術(shù)組及PD 4周組同時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 行為學(xué)檢測(cè)PD 4周組和PD 2周組大鼠分別于注射6-OHDA后第4周及第2周腹腔注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡（美國(guó)sigma公司）觀察并記錄30 min的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)；對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠于相應(yīng)處理后第4周注射等量阿撲嗎啡并觀察記錄。

1.3 外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所有大鼠各采集外周血1.5 mL，肝素抗凝搖勻。全血樣品應(yīng)用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞后分別加入抗大鼠FITC-CD4、PerCP eFluor 710-CD25抗體（美國(guó)eBioscience公司）各1.5 μL，經(jīng)孵育、洗滌和破膜固定后再加入PE-FoxP3抗體（美國(guó)eBioscience公司）5 μL，孵育洗滌后上流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)。

1.4 TH與iba-1、TH與GFAP免疫熒光雙標(biāo)染色4%多聚甲醛灌注固定大鼠后斷頭取腦，將腦組織脫水后冰凍連續(xù)冠狀切片（片厚40 μm）。通過(guò)免疫熒光染色法對(duì)腦片黑質(zhì)部位進(jìn)行酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）與離子鈣接頭蛋白分子-1（ionized calcium bindingadaptor molecule-1，iba-1）陽(yáng)性細(xì)胞、TH與膠原纖維酸性蛋白（glial fi?brillary acid protein，GFAP）陽(yáng)性細(xì)胞的雙標(biāo)染色，具體步驟如下：檸檬酸鈉修復(fù)液抗原熱修復(fù)5min，加入1：20000的鼠源性TH（美國(guó)sigma公司）和1：2000的兔源性iba-1（日本W(wǎng)ako公司）一抗，室溫孵育60 min后4℃過(guò)夜；加入DAM488（美國(guó)invitrogen公司）和生物素標(biāo)記的抗鼠源性的二抗（美國(guó)vector實(shí)驗(yàn)室），室溫避光孵育3 h；加入Hoechst和Avi-cy3，室溫避光孵育60 min；描片、晾干、封片后鏡下觀察。另取腦片行TH和GFAP雙標(biāo)染色，加入1：20000的鼠源性TH和1：1000的兔源性GFAP（丹麥Dako公司）一抗，余步驟同上。

1.5 結(jié)果判定每只大鼠的每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)選用6張切片，在同一光強(qiáng)度下分別計(jì)數(shù)腦片兩側(cè)的TH、iba-1、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。偏側(cè)TH陽(yáng)性神經(jīng)元的毀損率=（健側(cè)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)-毀損側(cè)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)）/健側(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100%；偏側(cè)iba-1、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的增加率=（毀損側(cè)iba-1、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)-健側(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)）/健側(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg比例的比較直接采用方差分析。多組間TH陽(yáng)性神經(jīng)元偏側(cè)毀損率、iba-1和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加率比較時(shí)發(fā)現(xiàn)各樣本總體方差不齊，故將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換，驗(yàn)證方差齊性后使用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較均應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)分析。Treg比例變化與TH陽(yáng)性神經(jīng)元?dú)p率及iba-1、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加率的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察部分PD大鼠腹腔注射阿撲嗎啡后可誘導(dǎo)出旋轉(zhuǎn)行為，表現(xiàn)為向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，呈首尾相接。對(duì)照組及假手術(shù)組注射阿撲嗎啡后無(wú)旋轉(zhuǎn)行為發(fā)生（見(jiàn)表1）。

2.2 大鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元染色結(jié)果對(duì)照組及假手術(shù)組黑質(zhì)兩側(cè)TH陽(yáng)性神經(jīng)元分布較多且密集，PD 4周組和PD 2周組毀損側(cè)TH陽(yáng)性神經(jīng)元均明顯減少（見(jiàn)圖1、2）。四組大鼠TH陽(yáng)性神經(jīng)元偏側(cè)毀損率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=218.83，P＜0.01）。其中，PD 4周組TH陽(yáng)性神經(jīng)元偏側(cè)毀損率較對(duì)照組和假手術(shù)組均增加（P＜0.01），且較PD 2周組毀損也更為嚴(yán)重（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

2.3 大鼠黑質(zhì)iba-1、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞染色結(jié)果對(duì)照組黑質(zhì)兩側(cè)iba-1陽(yáng)性細(xì)胞分布均勻而GFAP陽(yáng)性細(xì)胞則較少，假手術(shù)組iba-1和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞都在針道附近聚集激活，其它部位分布尚均勻。PD4周組和PD2周組大鼠iba-1和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞則均在毀損側(cè)黑質(zhì)處聚集激活且數(shù)量增加，激活后的細(xì)胞染色加深，突起變短增粗（見(jiàn)圖1、2）。四組大鼠iba-1陽(yáng)性細(xì)胞增加率（F=159.40，P＜0.01）和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加率（F=178.32，P＜0.01）有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中，PD 4周組iba-1和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加率較對(duì)照組及假手術(shù)組均增加（P＜0.01），但是PD 4周組較2周組這兩種膠質(zhì)細(xì)胞的增加率均減少（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

2.4 大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴細(xì)胞比例四組大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴細(xì)胞的比例分別為對(duì)照組（1.27%±0.06%），假手術(shù)組（0.88%±0.04%），PD 4周組（0.64%±0.08%），PD 2周組（0.85%±

表1 大鼠阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的情況（只）

表2 各組TH、iba-1、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞變化率

0.12 %）。四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=63.20，P＜0.01）。其中，PD 4周組CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴細(xì)胞的比例比對(duì)照組、假手術(shù)組及PD 2周組均降低（P＜0.01）。PD 2周組和假手術(shù)組CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴細(xì)胞的比例均比對(duì)照組低（P＜0.01），PD 2周組與假手術(shù)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖3）。

2.5 Treg比例變化與TH陽(yáng)性神經(jīng)元?dú)p率及iba-1、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加率的相關(guān)性外周血中Treg占T淋巴細(xì)胞比例的變化與TH陽(yáng)性神經(jīng)元?dú)p率（r=-0.59，P＜0.01）、iba-1陽(yáng)性細(xì)胞增加率（r=-0.87，P＜0.01）和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加率（r=-0.89，P＜0.01）均呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

Treg具有免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制功能，在維持機(jī)體外周免疫耐受、預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]，近期有研究表明Treg與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[3-5]。CD4+CD25highTreg是Treg的主要組成部分并能特異性地表達(dá)叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子FoxP3[6]。本研究發(fā)現(xiàn)PD大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg占T淋巴細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組及假手術(shù)組，且TH（多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物）陽(yáng)性神經(jīng)元損傷越嚴(yán)重Treg降低越明顯。

小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均參與腦內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)，既往有研究表明PD動(dòng)物甚至患者腦內(nèi)都存在小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和激活的情況[7-9]。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一現(xiàn)象，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元損傷時(shí)間及程度不同，膠質(zhì)細(xì)胞激活情況也不同。多巴胺能神經(jīng)元損傷早期較晚期，iba-1（小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物）陽(yáng)性細(xì)胞和GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物）陽(yáng)性細(xì)胞增生激活更為明顯。

圖1 黑質(zhì)處TH陽(yáng)性神經(jīng)元和iba-1陽(yáng)性細(xì)胞染色結(jié)果（4×）（iba-1/TH雙標(biāo)）（綠色箭頭示TH陽(yáng)性神經(jīng)元減少區(qū)域，紅色箭頭示iba-1陽(yáng)性細(xì)胞增加激活區(qū)域）。A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：PD2周組；D：PD4周組

圖2 黑質(zhì)處TH陽(yáng)性神經(jīng)元和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞染色結(jié)果（4×）（GFAP/TH雙標(biāo)）（綠色箭頭示TH陽(yáng)性神經(jīng)元減少區(qū)域，紅色箭頭示GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增加激活區(qū)域）。A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：PD2周組；D：PD4周組

圖3 CD4+CD25highFoxP3+Treg流式細(xì)胞檢測(cè)圖，A、B、E、F為CD4+CD25highTreg在外周血T淋巴細(xì)胞中所占比例，C、D、G、H為FoxP3在CD4+CD25highTreg中所占比例

Chi等[1]研究顯示，基因敲除水通道蛋白-4 （Aquaporin-4,AQP4）可引起小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Treg的減少，這些小鼠腹腔注射能夠引起PD的藥物1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氫吡啶（1-Meth?yl-4-Phenyl-1,2,3,6-etrahydropyridine,MPTP）后，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷程度較正常小鼠注射后更為嚴(yán)重，因而提出Treg可能是PD的保護(hù)性因素。由此，我們嘗試研究PD疾病本身是否也能夠引起Treg的改變，并進(jìn)一步探索引起Treg改變的原因。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，PD大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生激活的同時(shí)，外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg的比例在降低，且二者發(fā)生具有相關(guān)性。這提示PD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，CD4+CD25highFoxP3+Treg的比例的降低可能與腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。我們猜測(cè)，PD大鼠多巴胺能神經(jīng)元的損傷引起了小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生激活，增生激活后的膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)分泌IL-1、IL-6及TNF-α等多種炎癥因子[10,11]，這些炎癥因子通過(guò)破損的血腦屏障入血干擾Treg的增殖和活性[12]，從而引起Treg比例的降低。另外本研究發(fā)現(xiàn)，PD2周組大鼠膠質(zhì)細(xì)胞增生激活較4周組顯著，而PD4周組大鼠外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg比例降低則更為明顯。我們推測(cè)，這是由于膠質(zhì)細(xì)胞激活分泌的多種炎癥因子入血后主要是干擾Treg的增殖，對(duì)現(xiàn)已存在的Treg比例影響不大，所以Treg的改變?cè)赑D病程中相對(duì)于膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)有滯后性。

本研究也具有一定的局限性，我們只是觀察了PD大鼠外周血中Treg數(shù)量的變化，并未涉及Treg功能狀態(tài)的檢測(cè)，所以我們將在進(jìn)一步的研究中檢測(cè)PD大鼠體內(nèi)CD4+CD25highFoxP3+Treg的功能狀態(tài)及血清和腦脊液中多種炎癥因子的水平，并在體外實(shí)驗(yàn)中將膠質(zhì)細(xì)胞激活后的培養(yǎng)液與CD4+CD25highFoxP3+Treg共培養(yǎng)，觀察Treg的存活及增殖情況，這將有助于進(jìn)一步闡明PD引起CD4+CD25highFoxP3+Treg比例減少的基本機(jī)制。

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The changes of CD4+CD25highFoxP3+regulatory T cells in peripheral blood of Parkinson's disease rats.

SHEN Nan,ZHAO Yongbo,HUANG Dongya.Department of Neurology,First People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200080,China.Tel:021-63240090.

ObjectiveTo investigate the changes of regulatory T cells(Treg)in peripheral blood in the rat model of Parkinson’s disease(PD)and to study the correlation between the T cell changes and inflammation in the brain.Meth?odsSprague-Dawley rats were randomly divided into four groups:control group,sham-operated group,PD 4-week group and PD 2-week group.PD model was induced by 6-hydroxydopamine(6-OHDA).Immunofluorescence staining was used to detect the morphological and number of tyrosine hydroxylase(TH),ionized calcium bindingadaptor molecule-1(iba-1)and glial fibrillary acid protein(GFAP)positive cells in the substantia nigra.Flow cytometry(FCM)was used to examine CD4+CD25highFoxP3+Treg in the peripheral blood.ResultsThe relative neuronal loss of TH-positive cells in PD 4-week group was(91.33%±8.53%),which was significantly higher than that in control group and sham-operated group(P＜0.01).The relative neuronal loss of TH-positive cells was more severe in PD 4-week group than that in PD 2-week group(64.56%±17.94%vs.91.33%±8.53%)(P＜0.05).Meanwhile,in PD 4-week group,both iba-1-positive cells (82.60%±11.52%)and GFAP-positive cells(86.62%±6.80%)increased significantly,comparing with control group and sham-operated group(P＜0.01).Interestingly,the increase in iba-1-positive cells(104.89%±13.39%)and GFAP-posi?tive cells(117.92%±15.34%)was more obvious in PD 2-week group than in PD 4-week group(P＜0.05).Furthermore, FCM showed that the proportion of CD4+CD25highFoxP3+Treg in the peripheral blood in PD 4-week group was 0.64%± 0.08%,which was significantly lower than that in control group,sham-operated group and PD 2-weeks group(P＜0.01). In addition,the changes of Treg in peripheral blood was negatively correlated with the neuronal loss of TH-positive cells (r=-0.59,P＜0.01),and with the increase in iba-1 positive cells(r=-0.87,P＜0.01)and GFAP positive cells(r=-0.89, P＜0.01).Conclusions The present study have detected a decrease in Treg cell numbers in the peripheral blood in the rat model of PD,which may be related with the inflammation in the brain.

CD4+CD25highFoxP3+regulatory T cells Astrocyte Microglia Parkinson’s disease

R392

A

2012-12-12）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2013.08.008

☆ 上海市科委基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：11JC1411402）

* 上海市同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(上海 200120）

△上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科