雒曉芳，楊成波*

（1.西北民族大學(xué) 實驗中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 介入疼痛科，甘肅 蘭州 730050）

脂肪酶也就是三?；视王；饷?，其作用底物通常為油脂，通過催化作用可以使其產(chǎn)生脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯[1]。這個反應(yīng)通常是在油-水的界面上完成的[2]，如果底物能夠分散均勻或者是具有很好的水溶性，那么反應(yīng)就會不明顯或者是不反應(yīng)。脂肪酶的應(yīng)用廣泛，在食品工業(yè)中，可以用于食品原料的生產(chǎn)，也可以用來作為食品中的添加物質(zhì)[3]，還可以提高食品的品質(zhì)[4]；在醫(yī)藥領(lǐng)域中可以作為診斷工具以及治療藥物[5]；在能源領(lǐng)域，可以用來生產(chǎn)生物柴油[6]；在環(huán)境治理方面，可以用脂肪酶的微生物修復(fù)功能將含有脂肪酶以及其他成分的復(fù)合制劑來作用于海中的石油，就能夠很好地治理海洋中的石油污染[7]；在有機(jī)合成中的應(yīng)用，利用脂肪酶的催化反應(yīng)特性，即立體選擇性和區(qū)域選擇性，反應(yīng)條件溫和，無污染等，可以用來合成一些功能強(qiáng)大的化合物[8]。隨著社會發(fā)展以及科技的進(jìn)步，脂肪酶的應(yīng)用前景必定會是越來越好。

實驗通過分離選擇能夠得到了不同種的具有高效的降解石油的菌株，并且對脂肪酶的形成條件和脂肪酶活性的測定方法進(jìn)行探討，有利于工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的研究以及脂肪酶酶活測定方法多樣性探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

微生物菌株B1、D4、L5、A6均由西北民族大學(xué)微生物實驗室從甘肅隴東油田石油污染土樣中分離純化得到，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和生理生化初步分析，4株菌均為細(xì)菌，其分子生物學(xué)鑒定有待于進(jìn)一步進(jìn)行。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g/L，牛肉浸取物3.0g/L，NaCl 5.0g/L，瓊脂粉15.0，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，NaCl 5.0g/L瓊脂粉16.0g/L，pH 7.0。

分離培養(yǎng)基：NH4NO35.0g/L，KH2PO42.5g/L，Na2HPO412g/L，H2O0.5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，酵母粉0.5g/L，標(biāo)準(zhǔn)油5.0g/L，pH 5.5～6.0；按照《微生物學(xué)實驗》配制[9]。

1.1.3 試劑

橄欖油：江蘇省南通市黔臺商貿(mào)有限公司；聚乙烯醇（polyvinylalcohol，PVA）：中國醫(yī)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；（NH4）2·SO4、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaOH、無水乙醇、NaNO3等均為是國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓濕熱滅菌鍋：日本Hirayama公司；QH2-98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱：江蘇太倉華美生化儀器廠；ES-300E電子天平：長沙湘平科技發(fā)展有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BCD-235型冰箱：青島海爾股份有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；XW-80A漩渦混合器：江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

2%聚乙烯醇溶液：稱取10g聚乙烯醇（PVA）放入400mL蒸餾水中，置于電熱爐上面加熱至溶解完全，稍稍冷卻后定容至500mL，再用紗布過濾，保存濾液備用。

反應(yīng)底物（橄欖油乳化液）：把橄欖油與2%PVA溶液按照1∶3比例混合，用振蕩器振蕩3min～5min使之乳化，置于4℃冰箱保存。

0.025 mol/L磷酸緩沖液（pH7.5）：取KH2PO40.68g，加蒸餾水溶解并定容至20mL，即為甲液；取Na2HPO4·2H2O 8.95g，加水溶解并且定容至100mL，即為乙液；取甲液13mL并且倒入乙液100mL，制成pH值為7.5 濃度為0.25mol/L的磷酸緩沖液，使用前應(yīng)先稀釋10倍，即為實驗用緩沖液。

0.05 mol/L NaOH溶液：稱取NaOH 4.5g，加水溶解并定容至1000mL，用蒸餾水來稀釋一倍，此時NaOH溶液濃度即為0.05mol/L。

1.3.2 菌種的富集

（1）富集培養(yǎng)：挑取一環(huán)新鮮斜面種子，接于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)48h。

（2）分離：從渾濁的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中取樣，用無菌水作10倍稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋。取稀釋倍數(shù)分別為10、100、1000的稀釋液，各取0.2mL均與涂布于分離平板，顛倒培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中控制溫度37℃作用60h。如果細(xì)菌的菌落邊緣能夠出現(xiàn)黃色的透明圈，說明這種菌株能很好的降解油脂成分。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：通過分離得到高效降油菌后，移取富集培養(yǎng)液1mL轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基中，120r/min搖床恒溫37℃培養(yǎng)48h。

1.3.3 脂肪酶活性的測定方法

脂肪酶活性的測定采用橄欖油乳化法：用2個錐形瓶分別表示實驗組（A）和空白組（B），每瓶中各加入反應(yīng)底物4mL和緩沖液5mL，B 瓶中應(yīng)當(dāng)先加入15mL 95%vol乙醇；把兩瓶均放于恒溫水浴鍋中，控制溫度為40℃，5min后再在A、B瓶中分別添加入1mL粗提取液，作用15min后，在A 瓶中加入與B瓶等量的乙醇使反應(yīng)停止，然后滴加3滴的酚酞指示劑，用堿滴定體系變?yōu)槲⒓t色即停止。

1.3.4 脂肪酶活的定義及酶活計算

脂肪酶活的定義是在一定溫度和pH值條件下，水解甘油三酯每分鐘生成1μmol脂肪酸的酶量，即為一個活力單位，U/mL。脂肪酶酶活的計算公式：

式中：V1為實驗組所滴加堿的體積，mL；V2為空白組所用堿的體積，mL；50 為1mL 0.05mol/L NaOH 的微克分子數(shù)；n 為稀釋的倍數(shù)；t 為反應(yīng)所消耗的時間，min。

1.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗

在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，以脂肪酶活力為考察指標(biāo)，用可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖分別作為培養(yǎng)基中的碳源部分，用橄欖油、大豆油和甘油作為能夠促進(jìn)酶合成的添加物質(zhì)，采用L9（34）正交試驗（見表1）對菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for conditions of enzyme producing optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 B1菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

表2 B1菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions of producing enzyme optimization of B1 strain

B1菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果見表2。由表2可知，對B1菌種產(chǎn)脂肪酶活力的強(qiáng)弱作用分別為油含量＞碳源種類＞油種類＞碳源含量。當(dāng)加入10g/L的蔗糖+12.0g/L的橄欖油時，脂肪酶活力最高可達(dá)31.667U/mL。李鑫玲等[10]關(guān)于脂肪酶產(chǎn)酶條件優(yōu)化的研究表明，蔗糖能有效促進(jìn)脂肪酶的產(chǎn)生。

2.2 D4菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

D4菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果見表3。由表3可知，通過比較R值的大小，對于D4菌種酶合成的影響性大小的因素分別是碳源種類＞碳源含量＞油含量＞油種類。當(dāng)培養(yǎng)基中加入5.0g/L的可溶性淀粉+8.0g/L的橄欖油時，酶活性最高為51.667U/mL。雷曉燕等[11]有關(guān)產(chǎn)酶條件優(yōu)化的研究表明淀粉+植物油有利于脂肪酶的產(chǎn)生。

表3 D4菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions of producing enzyme optimization of D4 strain

2.3 L5菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

L5菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果見表4。由表4可知，通過比較R值的大小，對于L5菌種酶合成的影響性強(qiáng)弱的因素分別是油含量＞碳源種類＞油種類＞碳源含量。當(dāng)培養(yǎng)基中加入10.0g/L的可溶性淀粉+12.0g/L的橄欖油時，酶活力最高為36.334U/mL。余瓊等[12]報道橄欖油能夠很好的誘導(dǎo)相應(yīng)的菌株產(chǎn)脂肪酶，當(dāng)培養(yǎng)基中加入了糖類或者是非植物油時，能夠使脂肪酶的合成量減少。

2.4 A6菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

A6菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果見表5。由表5可知，通過比較R值的大小，對于A6菌種酶合成的影響性大小的因素分別是油種類＞碳源含量＞碳源種類＞油含量。當(dāng)培養(yǎng)基中加入5.0g/L的蔗糖+8.0g/L的橄欖油時，酶活力最高為23.334U/mL。

表4 L5菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions of producing enzyme optimization of L5 strain

表5 A6菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions of producing enzyme optimization of A6 strain

3 結(jié)論

通過正交試驗可知，B1菌種產(chǎn)脂肪酶活力的強(qiáng)弱作用分別為油含量＞碳源種類＞油種類＞碳源含量；D4菌種合成酶的影響因素分別是碳源種類＞碳源含量＞油含量＞油種類；L5菌種合成酶的影響性強(qiáng)弱的因素分別是油含量＞碳源種類＞油種類＞碳源含量；對于A6菌種來言，酶合成的影響性大小的因素分別是油種類＞碳源含量＞碳源種類＞油含量，由此可知，碳源種類和油含量對各種菌株產(chǎn)酶的影響較大。

4種細(xì)菌中，D4、A6菌株在油種類和油含量為8.0g/L的橄欖油，出現(xiàn)最大的脂肪酶活性，其中D4菌株的最適碳源條件為5.0g/L可溶性淀粉粉，而A6的最適碳源條件是5.0g/L蔗糖，且D4的產(chǎn)酶活性最高。B1、L5菌株的培養(yǎng)基中加入10.0g/L的可溶性淀粉和12.0g/L的橄欖油時酶活性最大，有研究表明蔗糖這類的速效碳源有利于細(xì)菌的脂肪酶的產(chǎn)生，并且碳源種類及含量，油種類和含量等等因素對兩種細(xì)菌影響的強(qiáng)弱性是一致的，均為油含量＞碳源種類＞油種類＞碳源含量。

通過分離選擇得到了具有高效的降解石油的不同菌株，并且對脂肪酶的形成條件和脂肪酶活性的測定方法進(jìn)行探討，有利于工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的研究以及脂肪酶酶活測定方法多樣性探討。對發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，顯著提高了其發(fā)酵液的脂肪酶活力，希望能為擴(kuò)大脂肪酶的生產(chǎn)源提供一定的基礎(chǔ)資料[13-15]。

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