夏麗，陳向梅，彭莉蓉，王世祥，王曉雯，左燕，張鵬，劉勤社，鄭曉暉

[摘要] 目的：研究蘇木對(duì)紅花中羥基紅花黃色素A（HSYA）的藥代動(dòng)力學(xué)的影響。方法：RP-HPLC測(cè)定紅花單煎液和紅花-蘇木配伍液灌胃后正常大鼠血漿中HSYA的血藥濃度，DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：紅花單獨(dú)給藥、紅花-蘇木配伍給藥，HSYA在體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)模型均為二室開(kāi)放模型；配伍后，HSYA的分布半衰期t_1/2α、吸收半衰期t_1/2Ka 、表觀分布容積VL/F顯著減小，達(dá)峰時(shí)間t_max有所提前。結(jié)論：蘇木可加快HSYA在體內(nèi)的吸收和分布，加快HSYA在體內(nèi)的代謝過(guò)程，減少HSYA在體內(nèi)的蓄積。

[關(guān)鍵詞] 紅花；蘇木；羥基紅花黃色素A；藥代動(dòng)力學(xué)

紅花、蘇木為活血化瘀之品，功用類同，二藥合用，相須配對(duì)，見(jiàn)諸多方劑，如《寧坤秘籍》之破靈丹，《證治寶鑒》之紅花蘇木湯，《何氏濟(jì)生論》之紅花活血湯等，多用治血滯不行，內(nèi)有瘀血等。紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L. 的干燥花，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛之功。羥基紅花黃色素A（HSYA）是其主要成分，藥理研究表明其有抗凝血、緩解心肌缺血等作用，臨床常用于防治腦缺血、心肌缺血、冠心病、腦血栓等疾病。蘇木為豆科植物蘇木Caesalpinia sappan L. 的干燥心材，具有活血祛瘀，消腫止痛之功。

紅花中HSYA成分檢測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究已有報(bào)道，但蘇木對(duì)紅花藥動(dòng)學(xué)的影響未見(jiàn)研究報(bào)道。本文以紅花中HSYA為指標(biāo)，研究?jī)烧吲湮楹筇K木對(duì)紅花藥動(dòng)學(xué)的影響，為其臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備 1100系列高效液相色譜儀（Agilent公司，美國(guó)）：G1312A二元泵，G1316A柱溫箱，G1315B二極管陣列檢測(cè)器；VER-TEX26型快速混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中國(guó)）；TGL^-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司）；Maxima超純水機(jī)（美國(guó)基因公司）；BP221S電子天平（Sartorius公司，德國(guó)）。

1.2 藥品與試劑 HSYA對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111637-200905）；紅花、蘇木藥材（購(gòu)于陜西省藥材公司，由西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院房敏峰副教授鑒定）；肝素鈉注射液（河北常山生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)100109）；色譜純甲醇（Fisher公司，美國(guó)）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)SD健康大鼠，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)陜醫(yī)動(dòng)證字2006105，雌雄兼用，體重200～230 g。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent TC-C ₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相0.3%甲酸溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫0～25 min，5%～35% B；25～30 min，35%～40% B；30～40 min，40%～60% B；檢測(cè)波長(zhǎng)0～30 min，280 nm；30～40 min， 403 nm。

2.2 藥材提取 紅花-蘇木合煎液：分別稱取紅花、蘇木粉碎藥材各150.0 g，混勻，加10倍量水浸泡0.5 h后，加熱回流提取2次，每次2 h，趁熱用布氏漏斗過(guò)濾，合并提取液，低壓濃縮至75 mL（生藥量以紅花計(jì)2.0 g·mL^-1），4 ℃冷藏備用。

紅花單煎液：稱取紅花粉碎藥材150.0 g，處理方法同上。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取HSYA 5.0 mg，溶解于5 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，制得1.00 g·L^-1的對(duì)照品溶液，4 ℃冷藏，備用。

2.4 血漿樣品的制備 大鼠隨機(jī)分成2組，即正常紅花組、正常紅花-蘇木組，每組6只，禁食，自由飲水，12 h后分別灌胃紅花水提液、紅花-蘇木水提液。每組均以20.0 g·kg^-1紅花生藥量灌胃，于給藥后0，5，10，20，30，45，60，90，150，210，270 min眼底靜脈叢取血0.3 mL，置于肝素化離心管中，在8 000 r·min^-1條件下離心10 min，取上層血漿置于離心管中，-20 ℃冷藏備用。前5個(gè)取血點(diǎn)尾靜脈注射0.3 mL生理鹽水，后邊各取血點(diǎn)腹腔注射0.3 mL生理鹽水以補(bǔ)充血容量。

2.5 血漿樣品的處理 取2.4項(xiàng)下血漿0.2 mL，加入20%三氯乙酸水溶液20 μL沉淀蛋白，渦旋2 min，在12 000 r·min^-1條件下離心10 min，取上清液，0.45 μm水系微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析。

3 結(jié)果

3.1 分析方法的專屬性及檢測(cè)限 分別取空白血漿供試品溶液和空白加標(biāo)血漿供試品溶液及含藥血漿供試品溶液各20.0 μL，在擬定條件下進(jìn)樣分析，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾HSYA的檢測(cè)，基線噪音小，說(shuō)明該液相條件具有良好的方法專屬性。HSYA檢出限為0.1 mg·L^-1（S/N=3），定量限為0.2 mg·L^-1（S/N=10）。

3.2 線性關(guān)系 在200 μL空白血漿中加入以甲醇稀釋的系列濃度的HSYA對(duì)照品溶液各20 μL，配制成HSYA質(zhì)量濃度分別0.20，0.40，0.78，1.56，3.13，6.25 mg·L^-1的系列空白血漿加標(biāo)品供試品溶液，按2.5項(xiàng)下方法處理，在擬定液相條件下進(jìn)樣分析，分別以質(zhì)量濃度（X，mg·L^-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，線性方程為Y=70.96X+0.69（r=0.999 8），HSYA在0.20～6.25 mg·L^-1線性關(guān)系良好。

3.3 精密度和回收率 取空白血漿，分別加入適量的HSYA對(duì)照品溶液，得到低、中、高3個(gè)濃度空白血漿加對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度6份；同時(shí)配制相同濃度的以水為基質(zhì)的對(duì)照品溶液，按照2.5項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，在擬定液相條件下進(jìn)樣20 μL

分析，同一樣品在1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，6日內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，求得日內(nèi)精密度、日間精密度，以血漿中HSYA與水溶液中HSYA的含量之比計(jì)算提取回收率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)：取空白血漿，分別加入適量的HSYA對(duì)照品溶液，得到低、中、高3個(gè)濃度空白血漿加對(duì)照品溶液；置于-20 ℃冷凍，24 h后于室溫下解凍，按照2.5項(xiàng)下樣品制備方法處理。在擬定液相條件下，進(jìn)樣量為20 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算HSYA的濃度變化。并將剩余樣品重新冷凍24 h。按上述步驟重復(fù)6次，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察凍融周期對(duì)樣品穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明HSYA3個(gè)濃度的RSD分別為3.71%，1.86%，0.75%。

短期穩(wěn)定性試驗(yàn)：取空白血漿，分別加入適量的HSYA對(duì)照品溶液，得到低、中、高3個(gè)濃度空白血漿加對(duì)照品溶液；室溫下放置2.0，4.0，8.0，10.0，12.0，24.0 h，按2.5項(xiàng)下樣品制備方法對(duì)血樣進(jìn)行處理。在擬定分析條件下，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算HSYA的濃度變化。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察溫度對(duì)樣品穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明HSYA 3個(gè)濃度的RSD分別為4.48%，1.86%，1.09%。

長(zhǎng)期穩(wěn)定性：以空白血漿配制HSYA高、中、低3個(gè)濃度的對(duì)照品血漿，置于-20 ℃冷凍，分別貯存1，2，4，6周后在室溫條件下解凍，按2.5項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，測(cè)得HSYA 3個(gè)濃度的RSD分別為5.9%，6.7%，5.0%，穩(wěn)定性良好。

3.5 藥代動(dòng)力學(xué)研究 取2.4項(xiàng)下血漿樣品在擬定的樣品處理和色譜分析條件下，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，計(jì)算其中HSYA的含量。用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析，藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2；HSYA的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。表2結(jié)果表明，紅花配伍前后，HSYA的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程均為二室開(kāi)放模型。配伍蘇木后，HSYA的吸收半衰期t_1/2Ka 、分布半衰期t_1/2α顯著減?。贿_(dá)峰時(shí)間T_max有所提前；消除半衰期t_1/2β、清除率CL/F變化不顯著，而表觀分布容積VL/F顯著減小。

4 討論

4.1 液相色譜條件的選擇 本研究對(duì)HSYA的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。考察了等度和梯度洗脫這2種洗脫方式，同時(shí)考察了不同配比甲醇-0.3%甲酸溶液的流動(dòng)相體系，最終確定甲醇-0.3%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫。此條件下，藥材中的HSYA以及血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)良好的分離，基線平穩(wěn)，目標(biāo)色譜峰對(duì)稱性良好，保留時(shí)間適宜。

選擇HSYA的最大吸收波長(zhǎng) 403 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，響應(yīng)值同等最高，保證了HYSA的檢測(cè)靈敏度。

4.2 血漿制備方法的選擇 本研究對(duì)血漿樣品的處理方法進(jìn)行考察，比較了不同種類蛋白沉淀劑20%三氯乙酸水溶液、乙腈、甲醇、10%高氯酸溶液及沉淀劑用量對(duì)提取回收率的影響，結(jié)果表明乙腈、甲醇沉淀蛋白，HSYA受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾較大，基線噪音大；10%高氯酸溶液沉淀蛋白，HSYA的回收率較低，不滿足生物樣品檢測(cè)要求；而0.1倍量20%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，基線平穩(wěn)，HSYA的提取回收率均在85%以上。

4.3 藥動(dòng)學(xué)研究 配伍蘇木后，HSYA的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程均為二室開(kāi)放模型；HSYA的吸收半衰期t_1/2Ka 顯著減小，達(dá)峰時(shí)間t_max有所提前，說(shuō)明蘇木可促進(jìn)HSYA在大鼠體內(nèi)的吸收；分布半衰期t_1/2α顯著縮短，提示配伍后HSYA在大鼠體內(nèi)的分布加快；消除半衰期t_1/2β 、清除率CL/F變化不顯著，而表觀分布容積VL/F顯著減小，提示蘇木可加快HSYA在大鼠體內(nèi)的消除。以上結(jié)果表明蘇木可加快HSYA在體內(nèi)發(fā)揮作用，加快HSYA的體內(nèi)代謝過(guò)程，減少HSYA在體內(nèi)的蓄積。本研究為蘇木-紅花的臨床合理應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國(guó)藥典. 一部[S]. 2010： 141.

[2] 臧寶霞， 金鳴， 李金榮. 羥基紅花黃色素A 抗凝作用的研究[J]. 中草藥， 2007， 38（5）： 741.

[3] 鄭為超， 陳鐸葆， 李兵， 等. 紅花黃素對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注模型的作用及機(jī)制研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2003， 19（9）： 1032.

[4] 陳鐸葆， 鄭為超， 趙輝， 等. 紅花總黃素對(duì)心肌缺血-再灌注損傷大鼠心功能的影響[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技， 2003， 10（5）： 290.

[5] 臧寶霞， 金鳴， 司南， 等. 羥基紅花黃色素A 對(duì)血小板活化因子的拮抗作用[J ] . 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2002， 37（9）： 696 .

[6] Zhu H， Wang Z， Ma C， et al. Neuroprotective effects of hydroxysafflor yellow A： in vivo and in vitro studies[J]. Planta Med， 2003， 69（5）： 429.

[7] 中國(guó)藥典. 一部[S]. 2010： 153.

[8] Li F， Pu R， Zhao H Y， et al. Stability and degradation of hydroxysafflor yellow A and anhydrosafflor yellow B in the safflower injection studied by HPLC-DAD-ESI-MSn[J]. J Chin Pharm Sci， 2011， 20： 47.

[9] Tian Y， Yang Z F， Li Y， et al. Pharmacokinetic comparisons of hydroxysafflower yellow A in normal and blood stasis syndrome rats[J]. J Ethnopharmacol， 2010， 129（1）： 1.

[10] 張海防， 郭健新， 黃羅生， 等. 羥基紅花黃色素A 在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2006， 37（5）： 456.

Pharmacokinetic effect of Sappan Lignum on hydroxysafflor

yellow A in Carthami Flos

XIA Li1， CHEN Xiang-mei1， PENG Li-rong2， WANG Shi-xiang1， WANG Xiao-wen3，

ZUO Yan3， ZHANG Peng3， LIU Qin-she1， 3， ZHENG Xiao-hui1， 4*

（1. College of Life Sciences， Northwest University， Xi′an 710069， China；

2. The Central Hospital of Xi′an， Xi′an 710086， China；

3. The People′s Hospital of Shanxi Province， Xi′an 710068， China；

4. Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen， Shenzhen 518057， China）

[Abstract] Objective： To investigate the pharmacokinetic effect of Sappan Lignum on hydroxysafflor yellow A （HSYA） in Carthami Flos. Method： Concentration of HSYA in rat plasma was detected by RP-HPLC after rats were orally administered with extracts of Carthami Flos or Carthami Flos combined with Sappan Lignum. Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 pharmacokinetic software. Result： In vivo pharmacokinetic models of HSYA were two-compartment open models in both of the Carthami Flos group and the Carthami Flos combined with Sappan Lignum group. After compatibility， HSYA showed a significant lower in apparent volumes of distribution of t_1/2Ka ， t_1/2αand V1/F， with slight advance in T_max. Conclusion： Sappan Lignum can accelerate absorption， distribution and metabolic process of HSYA in vivo and reduce its accumulation in vivo.

[Key words] Carthami Flos； Sappan Lignum； HSYA； pharmacokinetics

doi：10.4268/cjcmm20130224

[責(zé)任編輯 陳玲]