葉 瑤，于 健，汪琳姣，江仁美，陸桂榮，胡永玲

隨著經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展、人口老齡化，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成為我國(guó)第一大慢性肝病，且與美國(guó)、西歐、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家流行趨勢(shì)相似。NAFLD是由多種病因引起的一組綜合征，占脂肪肝總數(shù)的90%以上，且NAFLD患者大多伴有心血管危險(xiǎn)因素，與心腦血管疾病密切相關(guān)[1-2]。脂聯(lián)素(APN)是一種由脂肪細(xì)胞分泌的激素，具有促進(jìn)脂肪酸氧化、調(diào)節(jié)胰島素敏感性、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，是調(diào)節(jié)糖代謝和脂質(zhì)代謝的重要因子，與NAFLD的發(fā)病及病情進(jìn)展密切相關(guān)。研究顯示，脂聯(lián)素部分位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與NAFLD的發(fā)病及病情嚴(yán)重程度相關(guān)[3-4]，但以上研究的結(jié)論并不完全一致，可能是由于研究效能和種族人群多態(tài)性位點(diǎn)選擇的差異造成的。本研究旨在探討桂林市漢族老年NAFLD與脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年7—11月在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心診斷為NAFLD者150例為NAFLD組，其中男85例，女65例；年齡59～74歲，平均(66.2±4.0)歲；另選擇同期與NAFLD組年齡匹配的體檢正常者130例為對(duì)照組，其中男82例，女48例；年齡56～78歲，平均(65.8±4.1)歲。兩組性別構(gòu)成(χ2=1.189)、平均年齡(t=0.636)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。受試者為漢族，均簽署知情同意書(shū)。

1.2 NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2006版)》[5]，凡具備下列(1)～(5)中任一項(xiàng)和(6)或(7)項(xiàng)者即可診斷為NAFLD：(1)無(wú)飲酒史或飲酒(換算成乙醇)量男性<140 g/周，女性<70 g/周；(2)除外病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營(yíng)養(yǎng)、肝豆?fàn)詈俗冃缘瓤蓪?dǎo)致脂肪肝的特定疾?。?3)除原發(fā)病的臨床表現(xiàn)外，有乏力、消化不良、肝區(qū)隱痛、肝脾腫大等非特異性征象；(4)有超重/內(nèi)臟性肥胖、空腹血糖增高、血脂紊亂、高血壓等代謝綜合征相關(guān)組分；(5)血漿轉(zhuǎn)氨酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平可有輕至中度增高(<5倍參考值的上限)，通常以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平增高為主；(6)肝臟影像學(xué)表現(xiàn)符合彌漫性脂肪肝的影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(7)肝活檢組織學(xué)改變符合脂肪性肝病的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 身體測(cè)量指標(biāo) 所有受試者測(cè)量前至少30 min內(nèi)避免飲酒、吸煙、運(yùn)動(dòng)及飲用含咖啡因的飲料，統(tǒng)一測(cè)量身高、體質(zhì)量、血壓，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)，BMI=體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)。測(cè)量身高時(shí)免冠、脫鞋，數(shù)值精確至0.01 m；測(cè)量體質(zhì)量時(shí)免冠、脫鞋，空腹、排空膀胱，數(shù)值精確至0.1 kg；采用水銀柱血壓計(jì)測(cè)量右臂肱動(dòng)脈血壓，測(cè)量2次取平均值，數(shù)值精確到1 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo) 所有受試者隔夜禁食10 h，于次日晨起空腹抽取肘靜脈血，采用羅氏公司Cobas C501全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(FBG)、ALT、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿酸(UA)；其中FBG的檢測(cè)采用葡萄糖氧化酶法，ALT、AST的檢測(cè)采用速率法，TG的檢測(cè)采用GPO-POD酶法，TC的檢測(cè)采用膽固醇氧化酶法，HDL-C的檢測(cè)采用磷鎢酸-鎂法，LDL-C的檢測(cè)采用SUR法，UA的檢測(cè)采用尿酸酶法。

1.4 脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G單核苷酸多態(tài)性檢測(cè) 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(PCR-RFLP法)：(1)DNA提?。核惺茉囌咔宄靠崭钩槿§o脈血2 ml，EDTA抗凝，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司生產(chǎn))提取基因組DNA，-20 ℃保存，統(tǒng)一測(cè)量。(2)PCR擴(kuò)增：引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[6]，上游引物序列為5′-TGG TGG ACT TGA CTT TAC TGG TAG-3′，下游引物序列為5′-TAG AAG CAG CCT GGA GAA CTG-3′，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成；PCR反應(yīng)體系為25.0 μl：模板DNA 2.0 μl，上下游引物各0.5 μl，2×MasterMix(北京天根生化科技有限公司生產(chǎn))12.5 μl，ddH2O 9.5 μl；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入主循環(huán)，變性94 ℃ 45 s，退火62 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，終末延伸72 ℃ 7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃暫存；PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳及EB染色，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并判斷擴(kuò)增結(jié)果(見(jiàn)圖1)。(3)酶切鑒定基因型：酶切體系為20.0 μl：PCR產(chǎn)物10.0 μl，HhaI限制性?xún)?nèi)切酶(北京紐英倫生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))0.5 μl，10×NEB緩沖液2.0 μl，100×BSA 0.2 μl，ddH2O 7.3 μl；酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳及EB染色，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并根據(jù)條帶判斷基因型：脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G單核苷酸經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶HhaI酶切產(chǎn)生3種條帶，其中CC型不能被酶切，表現(xiàn)為1個(gè)條帶，CG型被酶切為2個(gè)條帶，GG型被酶切為3個(gè)條帶(見(jiàn)圖2)。

2 結(jié)果

2.1 兩組觀察指標(biāo)比較 NAFLD組BMI、SBP、DBP、FBG、ALT、TG、TC、LDL-C及UA水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，HDL-C水平低于對(duì)照組(P<0.01)；兩組AST水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。

2.2 NAFLD影響因素分析 以上述觀察指標(biāo)為自變量并結(jié)合專(zhuān)業(yè)知識(shí)進(jìn)行賦值(見(jiàn)表2)，以是否患NAFLD為因變量(否=0，是=1)，行單因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示性別、BMI、高血壓、FBG、TG、HDL-C、LDL-C、UA進(jìn)入回歸方程(P<0.05)；采用向前逐步引入法校正混雜因素，行非條件多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示性別、BMI、TG、UA進(jìn)入回歸方程(P<0.05，見(jiàn)表3)。

2.3 兩組脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G基因型和等位基因頻率比較 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，本研究樣本脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G基因型具有群體代表性(χ2=1.482，P=0.223)；兩組脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G基因型和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表4)。

2.4 不同基因型受試者觀察指標(biāo)比較 NAFLD組和對(duì)照組不同基因型受試者BMI、SBP、DBP、FBG、ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C及UA水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表5～6)。

表2 NAFLD影響因素的Logistic回歸模型中的變量賦值

Table2 Variable assignment in Logistic regression model of influencing factors of NAFLD

變量賦值性別男=0，女=1BMI(kg/m2)<25=0，≥25=1高血壓無(wú)=0，有=1FBG(mmol/L)<61=0，≥61=1ALT(U/L)≤38=0，>38=1AST(U/L)≤40=0，>40=1TG(mmol/L)<226=0，≥226=1TC(mmol/L)<622=0，≥622=1HDL-C(mmol/L)<155=0，≥155=1LDL-C(mmol/L)<414=0，≥414=1UA(μmol/L)≤420=0，>420=1

注：M為DNA Marker，1～10均為脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G單核苷酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖1 脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G單核苷酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure1 PCR result of SNP-11377C/G of APN

注：M為DNA Marker，1，2，4，6，8為CC型；3，9為CG型；5，7，10為GG型

圖2 脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G單核苷酸酶切產(chǎn)物電泳圖(限制性?xún)?nèi)切酶HhaI酶切)

Figure2 Enzyme result of SNP-11377C/G of APN

表1 兩組觀察指標(biāo)比較

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，SBP=收縮壓，DBP=舒張壓，F(xiàn)BG=空腹血糖，ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，UA=尿酸

表3 NAFLD影響因素的單因素和多因素Logistic回歸分析

表5 NAFLD組不同基因型受試者觀察指標(biāo)比較

注：*為H值

表6 對(duì)照組不同基因型受試者觀察指標(biāo)比較

注：*為H值

表4 兩組脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table4 Comparison of genotypes and allele frequencies of SNP-11377C/G of APN between the two groups

組別例數(shù)基因型CC CG GG等位基因C G對(duì)照組13083(638)40(308) 7(54) 206(792)54(208)NAFLD組15091(607)49(327)10(66)231(770)69(230)χ2值03810404P值08270525

3 討論

NAFLD是一種與遺傳易患性和胰島素抵抗密切相關(guān)的獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷，也是一種與高胰島素血癥、2型糖尿病(T2DM)、肥胖密切相關(guān)的臨床病理綜合征[4]，胰島素抵抗是其共同發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NAFLD組BMI、SBP、DBP、FBG、ALT、TG、TC、LDL-C及UA水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，表明NAFLD患者易合并超重和/或肥胖、高血糖、血脂紊亂和高血壓等，NAFLD是代謝綜合征累及肝臟的表現(xiàn)，同時(shí)NAFLD也是代謝綜合征的重要組分。

多因素Logistic回歸分析通過(guò)控制其他混雜因素的影響，研究某一因素對(duì)目標(biāo)疾病的作用，進(jìn)而提高研究結(jié)果的可靠性。NAFLD是由多種因素或疾病引起的疾病，本研究進(jìn)行的非條件多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，性別、BMI、TG、UA是NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，危險(xiǎn)度由大到小依次為BMI、 UA、TG、性別。Miyake等[7]研究發(fā)現(xiàn)，BMI是NAFLD最有效的預(yù)測(cè)因子，本研究結(jié)果與之一致，提示控制體質(zhì)量有助于預(yù)防NAFLD的發(fā)生、發(fā)展。而女性在更年期后卵巢功能衰退，雌激素對(duì)內(nèi)臟脂肪增加的抑制作用減弱可能與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

“脂毒性”可損害胰島β細(xì)胞的分泌功能，并抑制骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取，使肝臟糖異生作用增強(qiáng)，進(jìn)而加重胰島素抵抗和高血糖[8]，而慢性高血糖癥的“糖毒性”則可通過(guò)氧化應(yīng)激對(duì)胰島β細(xì)胞功能造成慢性、進(jìn)行性的不可逆損傷，降低胰島素分泌功能并引起胰島素抵抗[9]。胰島素抵抗通過(guò)高胰島素血癥和脂解作用兩種機(jī)制使脂質(zhì)由脂肪細(xì)胞向非脂肪細(xì)胞(尤其是肝細(xì)胞)內(nèi)轉(zhuǎn)移，造成肝細(xì)胞脂肪堆積，進(jìn)而形成NAFLD。NAFLD時(shí)脂質(zhì)代謝失調(diào)，增多的游離脂肪酸(FAA)干擾了胰島素與受體的結(jié)合，產(chǎn)生胰島素抵抗；FAA可損害肝細(xì)胞，而肝細(xì)胞脂肪堆積則影響肝細(xì)胞氧化代謝及能量轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致肝功能受損，血清ALT、AST水平升高；長(zhǎng)期高游離脂肪酸血癥可使胰島β細(xì)胞功能受損，導(dǎo)致胰島素分泌障礙和胰島素抵抗，從而誘發(fā)或加重糖代謝異常，最終形成“胰島素抵抗-糖毒性-NAFLD-脂毒性”的惡性循環(huán)。翟木緒等[10]研究表明，高尿酸血癥與NAFLD的發(fā)病密切相關(guān)，其可能原因?yàn)橐葝u素抵抗相關(guān)高危因素的聚集及其共同的病理生理機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，NAFLD組FBG及UA水平高于對(duì)照組，與以上研究結(jié)果一致。

研究表明，脂聯(lián)素與NAFLD關(guān)系密切，低脂聯(lián)素血癥在抑制NAFLD的發(fā)生中可能起著重要作用[11]。脂聯(lián)素可通過(guò)影響肝臟脂肪代謝、炎性因子產(chǎn)生及周?chē)M織對(duì)胰島素的敏感性等阻斷其對(duì)肝臟的初次打擊及二次打擊，從而抑制NAFLD發(fā)生與進(jìn)展。人脂聯(lián)素基因位于染色體3q27，而該區(qū)域存在代謝綜合征、T2DM和冠心病的易感位點(diǎn)。人脂聯(lián)素單核苷酸多態(tài)性通過(guò)影響脂聯(lián)素基因表達(dá)而調(diào)控脂聯(lián)素水平。脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)包括5′側(cè)翼區(qū)、外顯子1和內(nèi)含子1，其中，位于5′側(cè)翼區(qū)的-11377C/G與血清脂聯(lián)素水平相關(guān)[12]。

目前，關(guān)于NAFLD與脂聯(lián)素單核苷酸多態(tài)性關(guān)系的研究較少，且有關(guān)脂聯(lián)素單核苷酸多態(tài)性與NAFLD發(fā)病易患性關(guān)系的研究結(jié)果并不一致。Wong等[13]研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377G和+45G等位基因與NAFLD患者的高三酰甘油血癥相關(guān)；Gupta等[3]研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G和+45T/G與NAFLD患者的血清脂聯(lián)素水平降低相關(guān)；Tokushige等[14]研究表明，脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)+276、+45位點(diǎn)及肝纖維化、胰島素抵抗可能參與了NAFLD的發(fā)病。石勝利等[4]研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)276T/T和45G/G基因型可能是我國(guó)漢族人群NAFLD的易感基因，而黃春明等[15]則認(rèn)為脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)T45G多態(tài)性與NAFLD的發(fā)病易患性無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果顯示，兩組脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G基因型和等位基因頻率比較，均無(wú)明顯差異；不同基因型受試者BMI、SBP、DBP、FBG、ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C及UA水平比較，亦均無(wú)明顯差異，表明桂林市漢族老年NAFLD與脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G單核苷酸多態(tài)性無(wú)明顯相關(guān)性。但本研究未檢測(cè)血漿脂朕素水平，不能分析血漿脂聯(lián)素水平與NAFLD發(fā)病的相關(guān)性，也無(wú)法闡明脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11377C/G單核苷酸多態(tài)性是否通過(guò)影響血漿脂聯(lián)素水平而對(duì) NAFLD產(chǎn)生影響，所得結(jié)論也不能排除民族、地域差異以及本研究樣本含量較小的影響。

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