王白永，孫仁華，屈百鳴，郭振軍

心肺復(fù)蘇(CPR)是對心搏驟?；颊卟扇〉木S持人工循環(huán)和通氣的關(guān)鍵技術(shù)和方法，及時、有效的CPR可明顯提高患者的生存率[1]。CPR后隨著自主循環(huán)的建立會出現(xiàn)再灌注損傷，其程度影響著CPR患者的預(yù)后[2]。缺血再灌注損傷是一個包括中性粒細(xì)胞活化、多種因子及黏附分子過度表達(dá)、伴有多種炎性遞質(zhì)及信號傳導(dǎo)分子參加的復(fù)雜過程。研究發(fā)現(xiàn)，肝素可通過多種機(jī)制或途徑起到抗炎作用[3]，并對炎癥級聯(lián)反應(yīng)中的多種炎性遞質(zhì)有抑制作用。本研究的目的即觀察肝素對家兔CPR后核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康實驗用新西蘭家兔40只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由杭州醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物合格證號2009SCXK(浙)2009-0039。飼養(yǎng)于清潔環(huán)境中，自由飲水，12 h光照。采用隨機(jī)數(shù)字表法分3組：正常對照組8只；肝素組16只，給予肝素鈉200 U/kg；0.9%氯化鈉溶液組16只，給予0.9%氯化鈉溶液2 ml/kg。

1.2 手術(shù)操作 術(shù)前12 h禁食不禁水，20%烏拉坦3 ml/kg經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢推注，麻醉成功后，背部固定于家兔試驗手術(shù)臺，用動物皮膚電極連接標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，常規(guī)消毒皮膚，沿頸正中線縱行切開皮膚、氣管，置入小兒氣管導(dǎo)管，吸入氧氣3 L/min，縫合局部皮膚，分離右側(cè)股動脈，緩慢置入動靜脈留置針，監(jiān)測血壓。

1.3 誘發(fā)心室纖顫和CPR[4]肝素組和0.9%氯化鈉溶液組采用家兔體表貼膜法電刺激誘導(dǎo)心室纖顫，在胸壁心尖搏動點和右鎖骨下分別粘貼貼膜，接通100 V交流電，連續(xù)放電6 s后，觀察心電圖和動脈壓力波形，必要時重復(fù)直至出現(xiàn)心室纖顫波形，平均動脈壓<20 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，心室纖顫5 min后，按分組給予肝素鈉200 U/kg或等量0.9%氯化鈉溶液，用除顫儀接貼膜60 J除顫1次，并接小動物呼吸機(jī)輔助通氣,容控模式，潮氣量10 ml/kg，呼吸頻率45 次/min，吸入氧濃度100%，并于胸外心臟按壓，頻率180 次/min，按壓深度為胸廓前后徑的1/3，耳緣靜脈推注腎上腺素20 μg/kg，除顫不超過3次，所有上述操作均在3 min內(nèi)完成。CPR成功標(biāo)準(zhǔn)為心電圖出現(xiàn)竇性心律，平均動脈壓穩(wěn)定在60 mm Hg以上，并維持5 min為自主循環(huán)恢復(fù)，記錄CPR時間及自主呼吸恢復(fù)時間，自主呼吸恢復(fù)后停止機(jī)械通氣，繼續(xù)通過氣管導(dǎo)管吸氧(流量3 L/min)。CPR成功動物在CPR后按既定時間點持續(xù)觀察，在此期間不給予其他藥物。CPR 5 min未恢復(fù)自主循環(huán)者，為CPR失敗，停止搶救。

1.4 血流動力學(xué)數(shù)據(jù)采集 分別于造模前、CPR成功即刻(T0)、CPR成功后1 min(T1)、30 min(T2)、60 min(T3),記錄心率、平均動脈壓。

1.5 心室肌標(biāo)本采集 空白對照組氣管插管，股動脈置管后處死家兔，肝素組和0.9%氯化鈉溶液組分別于CPR成功后1 h處死家兔取左心室心肌厚3 mm，采用免疫組織化學(xué)方法(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)測定心肌NF-κB活化情況[5]。

1.6 免疫組織化學(xué)結(jié)果的判定 顯微鏡觀察并予以表達(dá)量高低評分。NF-κB陽性定位于心肌細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽性呈黃色或黃褐色。計分標(biāo)準(zhǔn)，參考Arai等[6]的計分標(biāo)準(zhǔn)，按著色細(xì)胞染色強度及面積計分：基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色適中者為2分，著色深者為3分；著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞的百分率≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，≥51%記3分。將每張切片的染色程度與染色細(xì)胞百分率得分相乘，其乘積為最后得分。0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，>6分為強陽性(+++)。將表達(dá)(-/+)劃為低表達(dá)組，(++～+++)劃為高表達(dá)組。

1.7 心肌TNF-α含量測定 空白對照組、肝素組和0.9%氯化鈉溶液組處死家兔，取心肌稱重，加入液氮手工研磨，磨成粉末后加入一定量磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.4)使標(biāo)本勻漿化，2 000～3 000 r/min，離心半徑13.5 cm，4 ℃低溫離心20 min，收集上清液，保存于-80 ℃冰箱。嚴(yán)格按試劑盒操作用酶聯(lián)免疫吸附劑法(ELISA)測心肌TNF-α含量。

2 結(jié)果

2.1 3組心室纖顫前體質(zhì)量、心率、平均動脈壓比較 3組心室纖顫前體質(zhì)量、心率、平均動脈壓比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2 肝素組與0.9%氯化鈉溶液組CPR效果比較 電擊致顫后，肝素組與0.9%氯化鈉溶液組均出現(xiàn)心室纖顫，各組均死亡1只，標(biāo)準(zhǔn)體外CPR后，肝素組自主循環(huán)恢復(fù)時間較0.9%氯化鈉溶液組縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組自主呼吸恢復(fù)時間及CPR成功率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.3 肝素組與0.9%氯化鈉溶液組CPR后心率和平均動脈壓變化比較 肝素組與0.9%氯化鈉溶液組CPR后不同時間點心率和平均動脈壓比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(心率：F組間=66.54，F(xiàn)時間=88.80，P<0.001；平均動脈壓：F組間=101.86，F(xiàn)時間=2.36，P<0.001,見表3)。

表1 實驗前各組家兔基本生理指標(biāo)情況

表2 肝素組與0.9%氯化鈉溶液組CPR效果比較

Table2 Comparison of the efficacy of CPR between the heparin group and the sodium chloride solution group

組別只數(shù)自主循環(huán)恢復(fù)時間(s)自主呼吸恢復(fù)時間(s)CPR成功率肝素組15100±10370±10314/1509%氯化鈉溶液組15157±23420±1219/15檢驗統(tǒng)計量值-865?-127?466P值<001 022 008

注：*為t值，余檢驗統(tǒng)計量值為χ2值；CPR=心肺復(fù)蘇

2.4 CPR后心肌NF-κB表達(dá)情況 光鏡下可見正常對照組心肌細(xì)胞內(nèi)有散在顆粒狀棕黃色沉淀物，其NF-κB為低水平表達(dá)(見圖1A)；肝素組可見胞內(nèi)有較多點顆粒及條索狀棕黃色沉淀，其NF-κB為低水平表達(dá)(見圖1B)；0.9%氯化鈉溶液組可見細(xì)胞核內(nèi)及胞質(zhì)遍布顆粒及條索狀棕褐色沉淀物，NF-κB呈高水平表達(dá)(見圖1C)。3組NF-κB表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(u=43.00，P<0.05)；其中肝素組和0.9%氯化鈉溶液組NF-κB高表達(dá)率較正常對照組升高，0.9%氯化鈉溶液組較肝素組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

表4 家兔CPR后心肌NF-κB表達(dá)情況(只)

2.5 CPR后心肌TNF-α含量比較 CPR 1 h后心肌TNF-α含量正常對照組為(126±23)pg/ml，肝素組為(221±36)pg/ml，0.9%氯化鈉溶液組為(300±29)pg/ml，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=135.21，P<0.01)；0.9%氯化鈉溶液組較肝素組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=-8.11，P<0.01)。

2.6 NF-κB的表達(dá)量與TNF-α含量的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，NF-κB的表達(dá)量與TNF-α含量呈正相關(guān)(r=0.801，P<0.01，見圖2)。

3 討論

在CPR發(fā)展的50年過程中，盡管已逐漸提高了CPR的成功率，但其預(yù)后一直是一個重大難題。其機(jī)制與缺血-再灌注、缺氧、應(yīng)激等一系列病理生理改變有關(guān)。國外研究發(fā)現(xiàn)，肝素可阻止由于缺血再灌注引起的心肌損傷[7]。家兔體表貼膜法電刺激誘導(dǎo)心室纖顫，不需開胸，避免開胸直接刺激家兔心臟以及對其他組織器官的影響，造模簡便、易于操作[8]，為家兔心搏驟停模型的常用方法。本研究在該模型基礎(chǔ)上，給予肝素鈉或等量0.9%氯化鈉溶液，之后進(jìn)行CPR，比較各組CPR成功率及NF-κB、TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝素用于電擊所致的家兔心室纖顫后，與0.9%氯化鈉溶液組比較，可使家兔自主循環(huán)恢復(fù)時間縮短，心率和平均動脈壓升高，NF-κB、TNF-α的表達(dá)水平降低；CPR成功率雖有一定的提高，但二者比較無差異，可能與實驗動物數(shù)量有關(guān)。

表3 肝素組與0.9%氯化鈉溶液組CPR后不同時間點心率和平均動脈壓變化比較

注：A：正常對照組，B：肝素組，C：0.9%氯化鈉溶液組

圖1 家兔CPR后心肌NF-κB的免疫組織化學(xué)結(jié)果(DAB染色，×200)

Figure1 The immunohistochemical results of NF-κB in the rabbits′ myocardium after CPR

圖2 家兔CPR后心肌NF-κB表達(dá)量與TNF-α含量的相關(guān)性

Figure2 The correlation between the expression of NF-κB and the level of TNF-α in the rabbits′ myocardium after CPR

研究發(fā)現(xiàn)，肝素除具有抗凝血、抗血栓、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)多肽生長因子、抑制細(xì)胞增殖、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)活性和藥理作用之外[7]，還具有阻抑白細(xì)胞黏附活化，抑制補體的激活，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受趨化因子、組胺、細(xì)菌內(nèi)毒素及氧自由基等損傷以及維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性等作用，這可能與肝素分子中存在多種可與黏附分子、細(xì)胞因子、補體等炎性遞質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞等結(jié)合的活性或受體部位以及聚糖結(jié)構(gòu)有關(guān)。Yao等[9]和Li等[10]在Wistar大鼠離體心臟缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)肝素可以抑制TNF-α的合成及缺血期離體心臟TNF-α的釋放，從而可以阻止由于缺血再灌注心肌損傷引起的左室功能低下。此外，近年來對心肌缺血再灌注損傷的研究表明，NF-κB轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的細(xì)胞因子TNF-α可激活血液及全身組織炎癥細(xì)胞引起炎癥的“瀑布效應(yīng)”，并直接引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的損傷[9]，甚至引起多臟器功能衰竭。因此，改善CPR后血流動力學(xué)，同時抑制心肌NF-κB的活化、減少TNF-α的釋放對改善CPR后患者的預(yù)后有著重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)肝素用于經(jīng)皮電擊致心室纖顫的家兔后，可以使家兔心肌NF-κB表達(dá)量降低、TNF-α含量減少，使家兔自主循環(huán)恢復(fù)時間縮短。其機(jī)制可能與肝素能較快改善家兔CPR后血流動力學(xué)，同時抑制心肌NF-κB的活化，使TNF-α的釋放減少，減輕缺血再灌注心肌損傷有關(guān)。本研究存在一定的不足，沒有設(shè)置不同濃度的肝素實驗組；且實驗動物數(shù)量不足，造模后各組動物只數(shù)不一致，使得量效關(guān)系和CPR成功率的分析上仍有欠缺。

本研究提示臨床CPR中給予肝素治療，將有可能提高CPR的成功率，同時改善患者預(yù)后，但同時還要注意肝素應(yīng)用可能導(dǎo)致的出血等并發(fā)癥。因此，其臨床應(yīng)用中還有待進(jìn)一步研究。

1 Dorn C,Massinger S,Wuzik A,et al.Xanthohumol suppresses inflammatory response to warm ischemia-reperfusion induced liver injury[J].Exp Mol Pathol,2013,94(1):10-16.

2 Laca L,Olejnik J,Vician M,et al.The effects of occlusive techniques on the short-term prognosis after liver resections[J].Hepatogastroenterology,2006,53(70):576-579.

3 Bozok S,Ilhan G,Yilmaz Y,et al.Protective effects of hyperbaric oxygen and iloprost on ischemia/reperfusion-induced lung injury in a rabbit model[J].Eur J Med Res,2012,17:14.

4 Ye L,Luo CZ,McCluskey SA,et al.Propofol attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in an in vivo rabbit model[J].J Surg Res,2012,178(2):e65-70.

5 Relja B,T?ttel E,Breig L,et al.Plant polyphenols attenuate hepatic injury after hemorrhage/resuscitation by inhibition of apoptosis,oxidative stress,and inflammation via NF-kappaB in rats[J].Eur J Nutr,2012,51(3):311-321.

6 Arai F,Kita T,Nakai T,et al.Histopathologic features of fat embolism in fulminant fat embolism syndrome[J].Anesthesiology,2007,107(3):509-511.

7 Xie X,Rivier AS,Zakrzewicz A,et al.Inhibition of selectin-mediated cell adhesion and prevention of acute inflammation by nonanticoagulant sulfated saccharides.Studies with carboxyl-reduced and sulfated heparin and with trestatin a sulfate[J].J Biol Chem，2000,275(44):34818-34825.

8 Chen MH,Xie L,Liu TW,et al.Epinephrine,but not vasopressin,improves survivalrates in an adult rabbit model of asphyxia cardiac arrest[J].Am J Emerg Med，2007,25(5):509-514.

9 Yao JR,Shi X,Hu S,et al.Effect of electroacupuncture on inflammatory injury induced by intestinal ischemia/reperfusion in rats[J].Zhongguo Zhen Jiu，2012,32(7):625-629.

10 Li SY,Fung FK,Fu ZJ,et al.Anti-inflammatory effects of lutein in retinal ischemic/hypoxic injury:in vivo and in vitro studies[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2012,53(10):5976-5984.