黃 健，黃韻祝，楊國(guó)珍，蹇孝麗

血漿三酰甘油(TG)水平升高是2型糖尿病(T2DM)患者血脂代謝異常的主要特征之一[1-2]。研究表明，人類(lèi)載脂蛋白A5(ApoA5)基因的單核苷酸突變(SNPs)對(duì)人群的TG水平有顯著影響，其中ApoA5-1131T>C及56C>G兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)血漿TG水平的影響較大[3]。由于基因多態(tài)性分布存在種族差異，因此本研究對(duì)貴州漢族健康人群及T2DM患者進(jìn)行ApoA5基因多態(tài)性研究，探討基因多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年3月—2013年3月貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的無(wú)親緣關(guān)系的T2DM患者192例為T(mén)2DM組，其中男88例，女104例；平均年齡(58.2±10.3)歲，均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選擇同時(shí)期我院體檢中心體檢血脂及血糖正常者206例為對(duì)照組，其中男82例，女124例；平均年齡(58.8±9.2)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性炎癥，風(fēng)濕免疫疾病，惡性腫瘤，心腦血管、肝、腎疾病，甲狀腺疾病。兩組均為貴州地區(qū)漢族人群，年齡、性別間有均衡性。

1.2 研究方法

1.2.1 血脂及血糖水平檢測(cè) 采用生化管抽取受試者清晨空腹外周血5 ml，離心半徑13.5 cm，3 000 r/min離心5 min,取上層血清使用奧林巴斯5400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TG、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及血糖水平。

1.2.2 外周血基因組DNA提取 抽取外周靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝用于提取基因組DNA。按亞能生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提基因組DNA。取5 μl基因組DNA與1 μl 6×loading buffer點(diǎn)樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，90 V電壓電泳60 min。在凝膠成像儀上觀察所提取的基因組DNA的亮度及純度(此試劑盒提取的DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳有一條清晰的約20 kbp的DNA條帶)。

1.2.3 ApoA5-1131T>C、56C>G位點(diǎn)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析 (1) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增：引物設(shè)計(jì)參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)如下：-1131T>C位點(diǎn)上游5′GGAGCTTGTGAACGTGTGTATGAGT 3′,下游5′CCCCAGGAACTGGAGCGAAATT 3′。56C>G位點(diǎn)上游5′GGCTCTTCTTTCAGGTGGGTCTCCG 3′，下游5′GCCTTTCCGTGCCTGGGTGGT 3′。由寶生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μl)：包括Premix Taq 12.5 μl，模板DNA 3 μl，上下引物各0.3 μl，雙蒸水補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物5 μl用2%的瓊脂糖凝膠中電泳(90 V 40 min)，在凝膠成像儀上觀察并攝像，結(jié)合DNA Marker判斷是否為目的DNA。(2) ApoA5-1131T>C位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切：取出現(xiàn)清晰的特異性條帶PCR產(chǎn)物，以MseⅠ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化(37 ℃水浴4 h)。酶切反應(yīng)體系如下(20 μl)：10×Buffer 2 μl，牛血清清蛋白(BSA)0.2 μl，MseⅠ0.5 μl，PCR產(chǎn)物8 μl，雙蒸水補(bǔ)足體積。酶切產(chǎn)物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，80 V電壓電泳2 h，在凝膠成像儀上觀察并攝像。(3) 56C>G位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切：取出現(xiàn)清晰的特異性條帶PCR產(chǎn)物，以TaqⅠ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化(65 ℃水浴2 h)。酶切反應(yīng)體系如下(10 μl)：10×Buffer 1 μl，BSA 1 μl，TaqⅠ0.5 μl，PCR產(chǎn)物8 μl，雙蒸水補(bǔ)足體積。酶切產(chǎn)物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，80 V電壓電泳2 h，在凝膠成像儀上觀察并攝像。

2 結(jié)果

2.1 ApoA5-1131T>C、56C>G位點(diǎn)PCR酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果 -1131T>C位點(diǎn)位于ApoA5基因啟動(dòng)子區(qū)域，酶切產(chǎn)物電泳后可出現(xiàn)3種情況：133 bp和21 bp兩條帶的為T(mén)T野生型純合子；只有154 bp一條帶的為CC突變型純合子；有154 bp、133 bp和21 bp三條帶的為T(mén)C型雜合子(見(jiàn)圖1)。

56C>G位點(diǎn)酶切產(chǎn)物有三種基因型：134 bp和23 bp兩條帶的為CC野生型純合子；只有157 bp一條帶的為GG突變型純合子；有157 bp、134 bp和23 bp三條帶的為CG型雜合子(見(jiàn)圖2)。

2.2 對(duì)照組與T2DM組ApoA5-1131T>C基因型和等位基因頻率分布比較 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，對(duì)照組(χ2=0.477，P=0.489)、T2DM組(χ2=1.597，P=0.206)ApoA5-1131T>C基因型分布均符合遺傳平衡定律，具有群體代表性。兩組的基因型和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)顯示攜帶TC+CC基因型者患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型的1.965倍(見(jiàn)表1)。

2.3 對(duì)照組及T2DM組ApoA5-1131T>C位點(diǎn)不同基因型者血脂水平比較 對(duì)照組TC+CC基因型攜帶者TG水平高于TT基因型攜帶者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T2DM組TC+CC基因型攜帶者TG水平高于TT基因型攜帶者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而對(duì)照組和T2DM組TC+CC基因型攜帶者與TT基因型攜帶者TC、LDL、HDL水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2、3)。

圖1 ApoA5-1131T>C位點(diǎn)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

Figure1 Genotyping of the T>C polymorphism at nucleotide -1131 of the ApoA5 gene by PCR-RFLP

2.4 ApoA5 56C>G位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布情況分析 ApoA5 56C>G位點(diǎn)位于ApoA5基因第二外顯子，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度157 bp。僅檢測(cè)出CC一種基因型，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他基因型，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，也無(wú)法分析這一位點(diǎn)與T2DM及血脂的關(guān)系，因此未做進(jìn)一步的探討。

圖2 ApoA556C>G位點(diǎn)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

Figure2 Genotyping of the C>G polymorphism at nucleotide 56 of the ApoA5 gene by PCR-RFLP

表1 對(duì)照組與T2DM組ApoA5-1131T>C基因型和等位基因頻率分布比較〔n(%)〕

Table1 Comparison of distributions of ApoA5-1131T>C genotype and allele between control group and T2DM group

組別例數(shù)基因型TT TC CC等位基因T C對(duì)照組206108(524)85(413)13(63)301(731)111(269)T2DM組19269(359)99(516)24(125)237(617)147(383)χ2值1245211666P值 0002 0001 OR值 1965 1682 95%CI(1314，2937)(1247，2269)

Table2 Comparison of lipoprotein levels in ApoA5-1131T>C defferent genotype in control group

基因型例數(shù)TGTCLDLHDLTT108156±054468±101304±070128±025TC+CC 98 184±087452±124313±065135±030t值-26851064-0870-1911P值 00080289 0386 0058

注：TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL=低密度脂蛋白，HDL=高密度脂蛋白

Table3 Comparison of lipoprotein levels in ApoA5-1131T>C defferent genotype in T2DM group

基因型例數(shù)TGTCLDLHDLTT 69 164±058419±118248±085115±031TC+CC123231±145446±128256±085107±029t值-4472-1516-06131841P值 0000 0132 05410067

3 討論

糖尿病是目前世界范圍內(nèi)繼腫瘤、心腦血管病后的第三位嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性疾病。糖尿病患者脂代謝紊亂一直是人們關(guān)注的重點(diǎn),其重要作用越來(lái)越受到人們的重視[5]。ApoA5基因是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)載脂蛋白基因，研究表明，人類(lèi)ApoA5基因的SNPs對(duì)人群的TG水平有顯著影響，而ApoA5調(diào)節(jié)TG的作用機(jī)制目前仍在研究當(dāng)中[6-7]。很多患者在糖代謝異常之前就已經(jīng)出現(xiàn)了脂代謝異常，血TG水平升高是其常見(jiàn)特點(diǎn)。Sane等[8]對(duì)6個(gè)家族性高三酰甘油血癥(HTG)家系患者進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)這類(lèi)家系中T2DM的發(fā)病率明顯增加，認(rèn)為空腹血TG水平增高是發(fā)生T2DM的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。Chiu等[9]發(fā)現(xiàn)，ApoA5基因多態(tài)性對(duì)胰島β細(xì)胞功能可構(gòu)成影響，從而影響血糖的調(diào)節(jié)，其作用機(jī)制可能為：ApoA5與肝素結(jié)合細(xì)胞因子(midkine)相關(guān)聯(lián)，進(jìn)而促進(jìn)胰島β細(xì)胞對(duì)胰島素的分泌。

本研究發(fā)現(xiàn)T2DM組的TC基因型頻率高于對(duì)照組，-1131C等位基因攜帶者(TC+CC)的TG水平高于未攜帶者(TT)，C等位基因攜帶者(TC、CC)的TG水平高于未攜帶者(TT),此結(jié)果與國(guó)內(nèi)的一些研究結(jié)果相似[10]。但肖輝等[11]對(duì)ApoA5-1131T>C基因多態(tài)性與維吾爾族T2DM的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，ApoA5-1131C基因多態(tài)性與新疆維吾爾族的T2DM的發(fā)生并不具有相關(guān)性，可能因研究對(duì)象的差異及不同地區(qū)人群的遺傳背景不同所致。要揭示其更加具體的關(guān)系尚有待更大樣本量的臨床研究以及基礎(chǔ)研究。對(duì)ApoA5-1131T>C基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，不同種族人群的-1131C等位基因頻率有差異。本研究顯示貴州地區(qū)漢族人群的ApoA5基因-1131C等位基因頻率與亞洲人相似，高于白種人，這與國(guó)內(nèi)的一些研究結(jié)果相似[12-13]。說(shuō)明C等位基因在亞洲人群中更為常見(jiàn)，提示該基因的變異對(duì)血TG水平的影響在亞洲人中可能更值得注意。ApoA5-1131T>C位點(diǎn)在不同種族人群當(dāng)中可以不同程度地影響人血漿TG水平，而對(duì)TC、LDL-C、HDL-C等的影響卻沒(méi)有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，原因或許是由于遺傳背景、觀察手段、樣本特征等這些因素造成的。

在進(jìn)行ApoA5 56C>G基因多態(tài)性研究中，只檢測(cè)出CC一種基因型，所以無(wú)法建立血脂水平與這個(gè)位點(diǎn)之間的關(guān)系。其可能原因是由于遺傳背景的差異使得中國(guó)人血脂變化對(duì)其不敏感，或是因?yàn)闃颖緮?shù)量不夠大導(dǎo)致應(yīng)該存在的差異未顯露出來(lái)。丁妍等[14]在對(duì)257名湖北省漢族人群56C>G位點(diǎn)研究中

得出G等位基因頻率小于1%，其認(rèn)為ApoA5基因 56C>G是一個(gè)突變點(diǎn)而不是一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。而Huback等[15]研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)位點(diǎn)的突變不僅使TG水平升高，還增加了患急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)。這說(shuō)明在不同人種之間遺傳背景差異很大。因此研究不同民族之間的這種差異，有助于解釋不同人群和個(gè)體對(duì)疾病的易患性。由于本次實(shí)驗(yàn)的樣本量較少，這個(gè)位點(diǎn)到底是突變點(diǎn)還是多態(tài)位點(diǎn)需要加大樣本量再做進(jìn)一步的證實(shí)。

1 姚麗穎,戢妍麗.老年糖尿病患者并發(fā)腦梗死與血脂水平的關(guān)系[J].中國(guó)老年學(xué),2012,32(17):3794-3795.

2 楊玉嬌，陳志剛.一體化管理對(duì)社區(qū)糖尿病患者糖化血紅蛋白和血脂的影響研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2012，15(4)：1140.

4 Talmud PJ,Hawe E,Martin S,et al.Relative contribution of variation within the APOC3/A4/A5 gene cluster in determining plasma triglycerides[J].Human Molecular Genetics,2002,11(24): 3039-3046.

5 李秋云,王彩寧,史麗萍,等.2 型糖尿病及前期患者胰島素抵抗與脂代謝紊亂的關(guān)系[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2011,13(8): 2716.

6 陳娟.載脂蛋白A5基因多態(tài)性與脂類(lèi)代謝疾病相關(guān)性研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012,33(5):554-556.

7 魏紅霞,陳娟,李雷,等.葡萄糖對(duì)鼠原代肝癌細(xì)胞中載脂蛋白A5基因表達(dá)的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2013,30(7):1430-1430.

8 Sane T,Taskinen MR.Does familial hypertriglyceridernia prdispose to NIDDM?[J].Diabetes Care,1993,16(11):1494-1501.

9 Chiu KC,Chiu YF,Boyadjian AA,et al.Impact of apolipoprotein A5 polymorphisms on insulin sensitivity and beta-cell function[J].Pancreas,2005,30(4): 328-332.

10 翟光華,聞平,郭蘭芳,等.型糖尿病患者 APOA5-1131T/C 基因多態(tài)性與血脂代謝和胰島素抵抗的關(guān)系研究[J].遺傳,2007,29(5): 541-546.

11 肖輝,張?jiān)旅?李涵秋,等.ApoA5-1131T>C基因多態(tài)性與維吾爾族2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,37(4):722-724.

12 李海新.2型糖尿病腎病患者ApoA5-1131T/C基因多態(tài)性與脂蛋白a水平相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010,25(6):92-93.

13 彭茜,廖蘊(yùn)華,霍冬梅,等.廣西京族人群載脂蛋白A5-1131T>C基因多態(tài)性與血脂的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學(xué),2013,34(6):857-860.

14 丁妍,朱名安,周有利,等.湖北漢族人群載脂蛋白A5遺傳多態(tài)性分析[J].遺傳，2007,29(5):554-558.

15 Huback JA,Skodova Z,Adamkova V,et al.The influence of APOAV polymorphisms(T-1131>C and S19>W) on plasma triglyceride levels and risk of myocardial infarction[J].Clin Genet,2004,65(2):126-130.