張 蕾，孫 浩

高血壓在我國已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人們健康的主要疾病，亦是導(dǎo)致腦血管疾病的重要危險因素。近年研究表明，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高可以造成血管內(nèi)皮損傷、血管平滑肌增生,并抑制一氧化氮(NO)合酶和前列環(huán)素 (PGI2)的合成,這些損害目前被認(rèn)為與高血壓的發(fā)病有關(guān)。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)對Hcy水平有重要影響,其基因C677T突變可影響該酶的活性,使Hcy代謝異常。但MTHFR基因C677T多態(tài)性與Hcy水平改變對高血壓發(fā)病的影響國外報道不一,國內(nèi)報道亦未涉及少數(shù)民族人群。本研究對傣族高血壓患者及健康者血清Hcy水平與MTHFR基因C677T多態(tài)性進(jìn)行檢測,以探討MTHFR基因C677T多態(tài)性、Hcy水平改變與傣族人群高血壓發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年3月在西雙版納傣族自治州進(jìn)行疾病普查時選取傣族高血壓患者133例，其中男76例，女57例；年齡29～81歲，平均60.5歲。不同時間在靜息狀態(tài)下測量血壓，3次均≥140/90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)(分次測量血壓的時間間隔不小于5 min)為高血壓。傣族健康者134例，其中男71例，女63例；年齡23～79歲，平均58.5歲。排除患有冠心病、周圍血管病、血液系統(tǒng)疾病、肝腎功能異常、甲狀腺疾病、嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、糖尿病、慢性胃腸道疾病、妊娠，近2周內(nèi)服用過甲氨蝶呤、NO、避孕藥、抗癲癇藥、葉酸、B族維生素、雌激素、異煙肼、酰胺咪嗪、煙酸、肼苯噠嗪者。

1.2 MTHFR分型方法 以聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測MTHFR基因C677T(rs1801133)突變情況。取250 μl外周血，使用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒(AxyGen中國)提取白細(xì)胞中的DNA。使用引物F:5′-GGAAGGTGCAAGATCAGAGC-3′和R:5′-CTGGGAAGAACTCAGCGAAC-3′對rs1801133進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為(PCR試劑來自TaKaRa公司)：DNA樣本20 ng,MgCl2(25 mmol/L)：1.2 μl；dNTP(2.5 mmol/L)：1.6 μl；正反向引物(5 μmol/L)各1 μl；Taq酶(55 U/μl)：0.16 μl；10×PCR Buffer：2.5 μl；加水至總體積20 μl。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，至第一步重復(fù)30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

取PCR產(chǎn)物5 μl，酶切緩沖液2 μl，Hinf Ⅰ內(nèi)切酶(1 U/μl)0.5 μl(TakaRa 中國)加水至20 μl，37 ℃酶切過夜，最后用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。

經(jīng)過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度428 bp，因為Hinf Ⅰ內(nèi)切酶在此片段上有兩個酶切位點(diǎn)，因此無論C677T位點(diǎn)突變情況如何，首先此片段都會被切為34 bp和394 bp 2條。因此經(jīng)Hinf Ⅰ酶切后，當(dāng)C677T位點(diǎn)的基因型為TT時，產(chǎn)生3條帶：34 bp、165 bp和229 bp；當(dāng)C677T位點(diǎn)基因型為CC時產(chǎn)生2條帶：34 bp和394 bp；當(dāng)此位點(diǎn)為雜合(T/C)時產(chǎn)生4條帶：34 bp、165 bp、229 bp和394 bp。由于34 bp片段在電泳時不明顯，因此只能觀察到其他條帶，但已經(jīng)能進(jìn)行基因分型(見圖1)。

1.3 血清Hcy水平測定 受檢者空腹12 h以上，清晨抽取靜脈血3 ml置于真空未抗凝試管中，在1 h內(nèi)分離血清，剔除溶血、脂血、黃疸標(biāo)本，嚴(yán)格按儀器操作程序進(jìn)行檢測，檢測前用試劑配套定標(biāo)樣品進(jìn)行定標(biāo)，標(biāo)本均在2 h內(nèi)檢測完畢。儀器使用日立7600-01大型全自動生化分析儀，由四川邁克生物科技股份有限公司提供Hcy檢測試劑盒，采用循環(huán)酶法測定Hcy水平。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 兩組患者性別及Hcy水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高血壓組患者年齡、收縮壓、舒張壓較健康組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

注：M：marker；1：TT等位基因型可見2條帶165 bp和229 bp；2：CT等位基因型可見3條帶165 bp、229 bp和394 bp；3：CC等位基因型可見1條帶394 bp (34 bp片段太小電泳不可見)

圖1 C677T經(jīng)過PCR擴(kuò)增片段Hinf Ⅰ酶切后電泳結(jié)果

Figure1 Electropherogram of C667T cut by PCR amplification fragment Hinf Ⅰ enzyme

表1 兩組一般資料比較

注：*為χ2值，余檢驗統(tǒng)計量值為t值；Hcy=同型半胱氨酸

2.2 C677T等位基因頻率分布 高血壓組與健康組C677T等位基因頻率分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.32，P=0.57，見表2)。

2.3 C677T突變與Hcy水平相關(guān)性 顯性模式和隱形模式不同基因型者Hcy水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

表2 高血壓組與健康組C677T等位基因頻率分布〔n(%)〕

Table2 Distribution of allele frequency of C677T in MTHFR in health adults and hypertension patients

組別等位基因數(shù)CT高血壓組266204(76.7)62(23.3)健康組268211(78.7)57(21.3)

表3 C677T突變與Hcy水平相關(guān)性

3 討論

Hcy又稱高半胱氨酸，于1931年由Vincent du Vigneaud首次從膀胱結(jié)石中分離得到，它是一種含硫的氨基酸，不屬于組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸，本身不參與蛋白質(zhì)的合成，也沒有特異的3個DNA堿基對其進(jìn)行編碼，體內(nèi)不能合成，它是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，只能來源于蛋氨酸(甲硫氨酸)的分解代謝。Hcy主要通過再甲基化和轉(zhuǎn)硫基途徑代謝。MTHFR、蛋氨酸合成酶(MS)、胱硫醚β合成酶(CBS)是Hcy代謝過程中的關(guān)鍵酶[1]。Hcy代謝酶的基因多態(tài)性可以影響酶的活性而影響血漿Hcy水平[2]。人類MTHFR基因定位于染色體1p36.3，全長1 980 bp，已發(fā)現(xiàn)具有高度多態(tài)性。該酶基因的C677T不耐熱突變是產(chǎn)生輕中度高Hcy最常見的一個遺傳決定因素[1]。在中國人中，腦卒中患者M(jìn)THFR基因純合子突變和雜合子突變的發(fā)生率顯著高于正常人，而T等位基因頻率也明顯高于正常對照組，說明MTHFR基因可能是腦卒中的易患基因之一。但也有研究顯示MTHFR基因C677T突變是同型半胱氨酸血癥的成因之一，但并不直接導(dǎo)致腦梗死，且與病程發(fā)展無關(guān)[3]。

較多的報道表明，Hcy通過多種作用機(jī)制導(dǎo)致血壓升高[4-7]：(1)血中Hcy升高可以促進(jìn)血管壁彈性纖維加速溶解，降低彈性纖維的含量，同時促進(jìn)膠原纖維的合成，從而改變動脈壁彈性。(2)Hcy有促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的作用，導(dǎo)致動脈壁的順應(yīng)性下降。(3)血Hcy可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)超氧化物的生成，使依賴于NO的血管舒張功能受限，引起血壓升高。(4)Hcy可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的聚集，造成血管的收縮。另外，較多資料顯示高血壓與血漿Hcy水平有顯著相關(guān)性[8-9]。

但是本研究表明，在傣族人群中，高血壓患者并沒有表現(xiàn)出較高的Hcy水平，與健康者之間沒有差異，其原因可能與種群差異、飲食習(xí)慣等有關(guān)系。體內(nèi)Hcy水平與飲食有著密切的關(guān)系，血漿中維生素B6、B12和葉酸水平越低，Hcy水平越高。

是否因為基因原因?qū)е麓鲎迦巳篐cy水平表達(dá)偏低，從而導(dǎo)致高血壓患者亦有較低的Hcy水平。本研究檢測了Hcy的代謝酶MTHFR基因C677T等位基因頻率，未發(fā)現(xiàn)兩組間的差異。這說明，在傣族人群可能還存在其他保護(hù)基因?qū)е翲cy的低表達(dá)。這些因素包括基因的種間差異、飲食結(jié)構(gòu)、環(huán)境等。進(jìn)一步研究少數(shù)民族與漢族之間關(guān)鍵基因的種間差異，對于預(yù)防甚至治療腦血管疾病具有重要的現(xiàn)實意義。另外，由于本研究樣本偏少，還需要進(jìn)行較大規(guī)模的普查研究以進(jìn)一步證實研究結(jié)論以及進(jìn)行更深入的研究。

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