楊 君，王慧玲，華方方

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指連續(xù)2次及以上的自然流產(chǎn)，是妊娠期婦女的常見并發(fā)癥之一[1]。目前關(guān)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因尚不完全清楚，約80%的流產(chǎn)者不存在生殖道感染、解剖、內(nèi)分泌、遺傳和自身免疫功能異常等病因[2]。妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)是由胎盤合體滋養(yǎng)層細胞和蛻膜細胞合成的母體血漿糖蛋白，研究顯示其在早期配子的發(fā)育、受精卵的著床、妊娠的維持以及胎兒和胎盤的生長發(fā)育等方面均發(fā)揮重要作用[3]。其表達水平隨著孕周的增加而增高，筆者在臨床工作中發(fā)現(xiàn)PAPP-A水平在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦蛻膜組織中的表達水平低于正常孕婦，本研究即探討了蛻膜組織中PAPP-A水平與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料病例入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者染色體檢查正常，無家族性遺傳病史，家族中未出現(xiàn)過自然流產(chǎn)者；(2)患者生殖道感染檢測呈陰性；(3)抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗精子抗體及抗子宮內(nèi)膜抗體檢查均為陰性；(4)無自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病等；(5)無心腦血管疾病及其他傳染性疾病病史；(6)配偶生殖系統(tǒng)和精液功能正常；(7)無吸煙、酗酒等不良生活習(xí)慣。選擇2010年6月—2012年6月我院收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦39例作為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組(RSA組)，年齡27～41歲，平均(33.1±5.4)歲；孕期5～7周，平均(6.1±0.8)周。選擇同時期在我院進行人工流產(chǎn)的健康早孕婦女30例作為對照組，年齡23～40歲，平均(32.1±5.2)歲；孕期為5～8周，平均(6.5±0.9)周。兩組受試者的年齡、孕周間具有可比性(t=0.143、0.217,P>0.05)。

1.2實驗材料與儀器蛻膜組織均通過負壓吸引術(shù)獲得，于液氮中保存使用；Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物；SYBY Green MiX 購自羅氏生物；96孔板購自Applied Biosystems；小鼠抗人PAPP-A單克隆抗體購自美國Abcam公司；羊抗鼠二抗購自Santa-cruz公司；DAB顯色液購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；蘇木精購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；國產(chǎn)分析純試劑；Real-time PCR擴增儀購自Applied Biosystems；LEICA RM2245石蠟切片機購自萊卡上海分公司；OLYMPUS BX5l顯微鏡購自日本奧林巴斯。

1.3實驗方法

1.3.1熒光定量PCR(RT-PCR)分析PAPP-A mRNA水平將蛻膜組織從液氮中取出，置于1 ml Trizol試劑中，勻漿后加入200 μl的氯仿，振蕩混勻后冰上放置5 min，12 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心15 min，吸取澄清部分加入等體積異丙醇中，混勻后冰上靜置10 min，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，向離心管中加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇溶液，輕輕振蕩5下后8 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的溶液溶解，定量后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為RT-PCR的模板。

PAPP-A引物，上游：5′-CTACTTGGATGTTAATGAGC-3′；下游：5′-TCCTGCCAACTCCTCCTCTG-3′。Actin作為內(nèi)參，上游：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3′；下游：5′-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3′，由上海英俊生物公司合成。引物合成后稀釋為10 μM。反應(yīng)體系如下：2×SYBR?Premix ExTaqTM 10 μl，上游引物和下游引物各0.6 μl，cDNA模板1∶100稀釋后取8.8 μl，總體積20 μl。按比例配制上述反應(yīng)液后分裝于96孔PCR板，每孔20 μl，然后以1 000 r/min離心2 min。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性：95 ℃,30 s；變性：95 ℃,3 s；退火延伸：60 ℃,30 s；構(gòu)建溶解曲線。表達量的計算采用ΔΔt模式。

1.3.2免疫組化分析PAPP-A水平將RSA組和對照組蛻膜組織用石蠟包被，切成5 μm厚的切片，貼于載玻片上進行脫蠟處理，結(jié)束后用磷酸鹽吐溫(PBST)緩沖液沖洗3次，用3%過氧化氫-甲醇液浸泡除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，PBST緩沖液沖洗3次后將玻片置于檸檬酸緩沖液中，微波加熱進行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后PBST緩沖液沖洗3次，用10%的山羊血清室溫封閉1 h，然后用10%山羊血清稀釋的一抗工作液4 ℃孵育過夜。次日在室溫回溫1 h后用PBST緩沖液沖洗3次，用二抗工作液室溫孵育30 min,PBST緩沖液沖洗3次后DAB顯色2～10 min，邊顯色邊觀察，著色后用自來水沖洗掉顯色液，蘇木精復(fù)染30 s，然后梯度乙醇脫水并用中性樹脂封固。同時設(shè)立陰性和陽性對照。陽性評定標(biāo)準(zhǔn):所有切片均采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)分析。每張切片隨機選取10個視野，放大400倍，分析陽性細胞占總細胞數(shù)的比例，分為4個等級，陰性(-)：陽性細胞數(shù)<5%；弱陽性(+)：陽性細胞數(shù)5%～25%；中等陽性(++)：陽性細胞數(shù)26%～50%；強陽性(+++)：陽性細胞數(shù)>50%。并采用Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)對標(biāo)本進行定量分析。

2　結(jié)果

2.1RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A mRNA水平比較從蛻膜組織中提取的RNA經(jīng)紫外線分析，光密度(OD)260/OD280為1.9～2.0，說明RNA純度較高，未受到DNA和蛋白質(zhì)污染。并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為RT-PCR的模板。RSA組蛻膜組織中PAPP-A mRNA水平較對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.152,P<0.05，見圖1)。

圖1　RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A mRNA水平比較

Figure1Comparison of PAPP-A mRNA between RSA group and control group in basal deciduas tissues

2.2RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A水平比較PAPP-A表達于蛻膜細胞的胞質(zhì)中(見圖2A)。兩組PAPP-A表達程度間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(u=4.995，P=0.000),其中RSA組PAPP-A表達以強陽性為主，對照組主要以弱陽性為主(P<0.05，見表1)。對RSA組和對照組標(biāo)本進行定量分析顯示，RSA組PAPP-A表達水平較對照組下降(t=2.591，P<0.05，見圖2B)。

2.3PAPP-A蛋白與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系以PAPP-A水平、年齡、孕周為自變量，以是否發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)為因變量進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示PAPP-A水平是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險因素之一〔b=1.722，OR=5.596，95%可信區(qū)間(2.406，13.017)，P=0.004〕。Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗結(jié)果顯示PAPP-A水平對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的預(yù)測具有較好的校準(zhǔn)度(χ2=3.158，P<0.05)。

表1RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A的表達程度比較

Table1Comparison of PAPP-A protein in RSA group and control group in basal deciduas tissues

組別例數(shù)-++++++對照組30219* 8 1 RSA組390 7 1121*

注：與組內(nèi)其他表達程度比較，*P<0.05

注：A為PAPP-A的組織分布，B為PAPP-A的水平比較

圖2RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP-A的組織分布及水平比較

Figure2Comparison of PAPP-A protein location and level between RSA group and control group in basal deciduas tissues

3　討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)占妊娠總數(shù)的1%，給孕婦心理和身體造成了極大的損傷，目前已經(jīng)成為臨床研究的焦點[4]。但復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機制比較復(fù)雜，包括染色體異常[5]、內(nèi)分泌異常[6]、免疫功能異常[7]、生殖器異常、感染因素[8]、全身性疾病、創(chuàng)傷刺激、不良生活習(xí)慣及環(huán)境因素等。但是約80%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)沒有明確的病因[9]。近年來，隨著臨床研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)PAPP-A在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦中表達異常，因此本研究探討了其與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)之間的關(guān)系，旨在為臨床診斷復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供一定的參考價值。

PAPP-A是與妊娠密切相關(guān)的一類大分子糖蛋白，近年來，研究顯示其在早期胚胎發(fā)育、受精卵著床、妊娠期維持、胎兒和胎盤生長以及發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[10]。PAPP-A主要由胎盤滋養(yǎng)層合體細胞和蛻膜細胞產(chǎn)生，然后分泌入血，從妊娠后第5周起可在孕婦血清中檢測到，并隨著孕周的增加其水平逐漸升高，到妊娠末期達到最高峰，產(chǎn)后水平逐漸下降[11]。目前PAPP-A已成為臨床早孕診斷和胎兒健康程度的主要監(jiān)測指標(biāo)。筆者在長期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清中PAPP-A水平明顯低于正常孕婦，這一結(jié)果跟目前部分報道一致[12]。

本研究顯示，與對照組比較，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦蛻膜組織中PAPP-A mRNA的水平明顯下降；為了進一步分析PAPP-A水平，采用免疫組化的方法分析了蛻膜組織中PAPP-A的表達變化，結(jié)果顯示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦蛻膜組織中PAPP-A水平明顯低于對照組，蛻膜組織中PAPP-A的表達下調(diào)導(dǎo)致了入血的PAPP-A水平下降，所以表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清中PAPP-A水平低于對照組孕婦。進一步行Logistic回歸分析顯示PAPP-A水平下調(diào)是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險因素，提示其在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷中具有較好的準(zhǔn)確性。

綜上所述，PAPP-A在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織中表達水平明顯下調(diào)，其下調(diào)是導(dǎo)致發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因之一。

1Li TC,Makris M,Tomsu M,et al.Recurrent miscarriage:aetiology,management and prognosis[J].Hum Reprod Update,2002,8(5):463-481.

2Wu Z,You Z,Zhang C,et al.Association between functional polymorphisms of Foxp3 gene and the occurrence of unexplained recurrent spontaneous abortion in a Chinese Han population[J].Clin Dev Immunol,2012,20(12):896458.

3沈旭娜，唐少華，楊黎文，等.妊娠相關(guān)血漿蛋白A和游離β-hCG在預(yù)測稽留流產(chǎn)和異位妊娠中的診斷價值[J].中國計劃生育學(xué)雜志,2009,17(2):107-108.

4Sugiura-Ogasawara M,Ozaki Y,Katano K,et al.Abnormal embryonic karyotype is the most frequent cause of recurrent miscarriage[J].Hum Reprod,2012,27(8):2297-2303.

5El-Dahtory FA.Chromosomal abnormalities as a cause of recurrent abortions in Egypt[J].Indian J Hum Genet,2011,17(2):82-84.

6Todorova-Ananieva K.Autoimmune thyroid disorders and reproductive failures[J].Akush Ginekol (Sofiia),2009，48( Suppl 2):26-30.

7劉西茹，李尚為，汪燕，等.CTLA-4抗體誘導(dǎo)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者Th1/Th2轉(zhuǎn)換的體外研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,32(12):1265-1307.

8Nigro G,Mazzocco M,Mattia E,et al.Role of the infections in recurrent spontaneous abortion[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2011,24(8):983-939.

9Fatima N,Ahmed SH,Salhan S,et al.Study of methyl transferase (G9aMT) and methylated histone (H3-K9)expressions in unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) and normal early pregnancy[J].Mol Hum Reprod,2011,17(11):693-701.

10聞靜，任海穎，翟建軍.妊娠相關(guān)蛋白A與孕酮聯(lián)合測定在判斷早期妊娠中的價值[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007,28(5):649-651.

11許希中，余進進，陳小平，等.妊娠相關(guān)蛋白-A及其他妊娠相關(guān)激素對早期不良妊娠結(jié)局的預(yù)測價值探討[J].現(xiàn)代保健·醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究,2006,3(12):1-3.

12謝愷俐.正常妊娠孕婦和子癇前期患者妊娠中晚期血清和胎盤中妊娠相關(guān)蛋白濃度的變化[J].安徽醫(yī)藥,2009,13(2):166-168.