楊治芳，吳 芳，湯佳珍，劉建英

橋本甲狀腺炎(HT)又稱慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病之一，自身免疫損傷是本病導(dǎo)致甲狀腺功能減退(甲減)的主要機(jī)制。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在阻止自身免疫反應(yīng)、維持免疫耐受中發(fā)揮著重要作用[1]，F(xiàn)OXP3是維持Treg發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[2]。本研究通過觀察不同甲狀腺功能狀況HT患者外周血Treg的表達(dá)，旨在探討HT的免疫學(xué)機(jī)制。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2010年10月—2012年10月我院內(nèi)分泌科門診及住院部、甲狀腺外科住院部HT患者46例為病例組，年齡25～60歲，平均(40.9±11.2)歲；診斷標(biāo)準(zhǔn)：血清甲狀腺過氧化物酶抗體(TPO-Ab)和(或)甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)水平明顯升高，甲狀腺外科手術(shù)后病理或細(xì)針穿刺涂片表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；根據(jù)患者甲狀腺激素水平分為甲狀腺功能正常組16例，亞臨床甲減組14例，臨床甲減組16例。選取同期在我院體檢的與病例組患者年齡、性別相匹配的健康人20例為對(duì)照組，年齡26～54歲，平均(39.4±7.5)歲。所有入選者無類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病，近3個(gè)月內(nèi)未服用過激素類藥物、免疫抑制劑等。

1.2主要試劑和儀器鼠抗人異硫氰酸熒光素(FITC)-CD4、別藻青蛋白(APC)-CD25、藻紅蛋白(PE)-FOXP3及同型對(duì)照單克隆熒光抗體、細(xì)胞固定劑與打孔劑均購自美國(guó)eBioscience公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀為BD公司生產(chǎn)。CD4+T細(xì)胞磁珠分離試劑盒購自Dynal公司。磁分離架為Dynal公司生產(chǎn)。Trizol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀為Bio-Rad公司生產(chǎn)。Sybe green定量PCR試劑盒購自Toyobo公司。

1.3方法

1.3.1外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離與收集獲得所有入選者知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，抽取其外周靜脈血6 ml置于肝素抗凝管，2 ml置于血常規(guī)管；肝素抗凝管于采集后2 h內(nèi)分離PBMC。Hank′s緩沖液稀釋外周血標(biāo)本，密度梯度離心法收集PBMC，加1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)到2×106/ml。

1.3.2測(cè)定TregPBMC 1 ml加入5 μl FITC-CD4和5 μl APC-CD25單克隆熒光抗體，4 ℃避光20 min。磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)洗滌后，加入固定/穿膜液400 μl，室溫避光40 min，PBS緩沖液洗滌后，加入緩沖液800 μl，室溫避光20 min。PBS緩沖液洗滌后，加入5 μl PE-FOXP3單克隆熒光抗體或同型對(duì)照PE-IgG1，4 ℃避光20 min，PBS緩沖液洗滌后，加入固定液100 μl，于1周內(nèi)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3流式細(xì)胞檢測(cè)采用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，WinMDI 2.9軟件進(jìn)行分析。根據(jù)前向角和側(cè)向角圈定淋巴細(xì)胞群，設(shè)門，根據(jù)同型對(duì)照樣品調(diào)整熒光檢測(cè)器電壓，設(shè)定陰性細(xì)胞群≥99.5%，根據(jù)獨(dú)立細(xì)胞染色樣品調(diào)整儀器的熒光補(bǔ)償值。

1.3.4CD4+T細(xì)胞分離2 ml抗凝血中加入72 μl CD4磁珠，顛倒混勻2～3次，置低溫?fù)u床內(nèi)50 r/min混勻，4 ℃孵育30 min，置于磁分離架上2～3 min，棄上清液，用PBS緩沖液或2%胎牛血清(FCS)緩沖液洗滌4～5次，重懸于1 ml Trizol，-70 ℃保存，用于提取總RNA。

1.3.5CD4+T細(xì)胞FOXP3 mRNA的表達(dá)(1)提取總RNA：按照說明書方法提取，用紫外或可見光分光光度儀檢測(cè)總RNA的A260、A280濃度及A260/A280。(2)cDNA的合成：取1 μg RNA置于薄壁管，70 ℃變性10 min。依次加入10×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液2 μl，25 mmol/L MgCl22 μl，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)2 μl，寡脫氧胸苷酸(oligo-dT)1 μl，RNA酶抑制劑(RNasin)0.5 μl，鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶0.625 μl，加入去RNA酶水使終反應(yīng)體積為20 μl，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃冰浴(以上均在PCR儀完成)。所得cDNA放置于-20 ℃保存。(3)Sybe green熒光定量PCR：引物序列：FOXP3：上游5′-CAAGTTCCACAACATGCGAC-3′，下游5′-ATTGAGTGTCCGCTGCTTCT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度91 bp。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)：上游5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，下游5′-GGCAACAATATCCACTTTA CCAGAGT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度101 bp。反應(yīng)條件：94 ℃ 20 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s。均設(shè)3個(gè)復(fù)管，以GAPDH作為內(nèi)參照，F(xiàn)OXP3 mRNA與GAPDH mRNA比值為其相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1不同甲狀腺功能狀況HT患者臨床特征甲狀腺功能正常組、亞臨床甲減組、臨床甲減組患者的性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、TGAb、TPO-Ab水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2Treg占CD4+T細(xì)胞比例對(duì)照組Treg占CD4+T細(xì)胞比例為(4.67±1.21)%，病例組為(2.78±1.32)%，病例組Treg占CD4+T細(xì)胞比例低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.85,P<0.01)；甲狀腺功能正常組、亞臨床甲減組、臨床甲減組Treg占CD4+T細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

表1　不同甲狀腺功能狀況HT患者臨床特征比較

注：*為χ2值；BMI=體質(zhì)指數(shù)，F(xiàn)T3=游離三碘甲狀腺原氨酸，F(xiàn)T4=游離甲狀腺素，TSH=促甲狀腺激素，TGAb=甲狀腺球蛋白抗體，TPO-Ab=甲狀腺過氧化物酶抗體

2.3相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，Treg的表達(dá)與患者年齡(r=-0.242)、TPO-Ab水平(r=-0.268)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別(r=0.111)、BMI(r=0.004)、TGAb(r=0.149)水平無直線相關(guān)性(P>0.05)。

2.4CD4+T細(xì)胞FOXP3 mRNA的表達(dá)磁珠分離的CD4+T細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定，純度達(dá)95%以上。對(duì)照組CD4+T細(xì)胞FOXP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(5.08±1.87)，病例組(抽取20例)為(3.59±0.37)，病例組CD4+T細(xì)胞FOXP3 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.65，P<0.05)。

3　討論

HT是器官特異性自身免疫疾病，臨床表現(xiàn)差異較大，由于其在疾病早期無特殊臨床表現(xiàn)，往往發(fā)展為臨床甲減才被發(fā)現(xiàn)。臨床工作中主要依據(jù)TGAb和TPO-Ab水平來判斷HT患者進(jìn)展為甲減的概率，但是部分患者TGAb和(或)TPO-Ab持續(xù)高水平陽性多年而甲狀腺功能正常；部分患者則很快進(jìn)展為甲減，需要終生甲狀腺激素治療。目前，關(guān)于不同甲狀腺功能狀況HT患者Treg水平變化的研究報(bào)道較少。為防止HT甲減的出現(xiàn)及進(jìn)展，有必要進(jìn)一步探討其免疫學(xué)機(jī)制。

Treg的功能降低在自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Treg的數(shù)量減少和功能降低在Graves病向HT轉(zhuǎn)換、出現(xiàn)甲減的過程中起重要作用；McLachlan等[4]研究認(rèn)為，Treg可能在HT患者出現(xiàn)甲減中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，病例組Treg占CD4+T細(xì)胞比例及FOXP3 mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，存在Treg的缺陷，而不同甲狀腺功能狀況HT患者Treg占CD4+T細(xì)胞比例間無差異，分析其原因可能是由于HT患者的甲狀腺功能狀況與自身免疫活動(dòng)無直接相關(guān)性，也可能與本研究樣本量較小有關(guān)；同時(shí)，由于獲取的細(xì)胞數(shù)有限，本研究只抽取了病例組中20例HT患者檢測(cè)CD4+T細(xì)胞FOXP3 mRNA的表達(dá)，也未進(jìn)行亞組分析。

Zhao等[5]研究認(rèn)為HT患者Treg的表達(dá)水平隨著年齡增長(zhǎng)而下降，但兩者的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議；Karanikas等[6]研究表明，HT患者TPO-Ab水平升高與Th1細(xì)胞因子分泌增加相關(guān)，認(rèn)為TPO-Ab水平升高利于自身反應(yīng)性T細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，HT患者Treg的表達(dá)與年齡、TPO-Ab水平呈負(fù)相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。

在HT的免疫進(jìn)程中還有其他CD4+輔助性T細(xì)胞的參與，CD4+T細(xì)胞亞群中的Th17細(xì)胞是誘導(dǎo)自身免疫的輔助性T 細(xì)胞，與Treg功能相拮抗。Th17細(xì)胞觸發(fā)的免疫反應(yīng)在碘誘導(dǎo)的HT自發(fā)性動(dòng)物模型NOD-H2h4鼠發(fā)病中起著不可或缺的作用[7]。濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh細(xì)胞)通過細(xì)胞因子IL-6和IL-21來調(diào)節(jié)B細(xì)胞的功能，可對(duì)自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生過強(qiáng)的輔助信號(hào)，可能引起抗體介導(dǎo)的自身免疫性損傷。Tfh細(xì)胞調(diào)節(jié)異常時(shí)，非淋巴組織產(chǎn)生大量的IL-21，可激發(fā)廣泛效應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫性炎癥。新近研究表明，自身免疫性甲狀腺炎患者外周血中Tfh細(xì)胞比例明顯升高，且HT患者甲狀腺內(nèi)可檢測(cè)到Tfh細(xì)胞，甲狀腺內(nèi)IL-21和Bcl6 mRNA表達(dá)水平升高[8]。因此，如能在今后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，加入Th17細(xì)胞和Tfh細(xì)胞作為檢測(cè)項(xiàng)目，將有助于進(jìn)一步了解HT的免疫學(xué)機(jī)制。

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