張宇婷曹雅男解綬啟周志剛

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

密碼子優(yōu)化提高aiiaB546畢赤酵母表達(dá)活性

張宇婷1曹雅男1解綬啟2周志剛1

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶是一類特異性降解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類信號分子(AHLs)的蛋白水解酶, 通過水解AHLs生成酰基高絲氨酸, 使AHLs失去活性, 從而阻斷病原菌的群體感應(yīng)路徑, 使病原菌失去致病能力, 其廣泛存在于多種微生物中[1,2]。近年來N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶作為一種新型抗菌策略(群體感應(yīng)淬滅策略)的工具酶而成為水產(chǎn)養(yǎng)殖防治細(xì)菌性疾病研究的熱點(diǎn)[3—5]。

本研究室陳瑞東等在畢赤酵母中成功表達(dá)了Bacillus sp. B546來源的N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因(aiiaB546),得到的重組酶具有良好的pH適性和穩(wěn)定性以及抗大多數(shù)金屬離子和蛋白酶的能力, 適合水產(chǎn)養(yǎng)殖條件, 經(jīng)3.7 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵, 其表達(dá)量大幅提升, 使低成本獲得大量的AiiaB546成為可能, 并且以酶制劑的形式通過活體注射的方式成功衰減了嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila ATCC 7966)在錦鯉(Cyprinus carpio)中的致死能力。根據(jù)所知, 這是首次在畢赤酵母中高效表達(dá)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶并通過注射該酶衰減嗜水氣單胞菌的毒力。因此本實(shí)驗(yàn)具有潛在的抗菌策略探討及水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用的價(jià)值, 但為了大量獲得廉價(jià)可商業(yè)化的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶, 進(jìn)一步提高生物反應(yīng)器的表達(dá)酶活顯得尤為必要。

由于遺傳密碼具有簡并性, 一種氨基酸可以有1—6個(gè)使用頻率不同的同義密碼子。對于特定的物種, 高表達(dá)的基因往往使用部分特定的同義密碼子, 這些密碼子被認(rèn)為是該物種高表達(dá)基因的優(yōu)越密碼子, 這種現(xiàn)象稱為密碼子偏愛性。密碼子的偏愛性使得克隆的外源基因往往難以在異種生物細(xì)胞高效表達(dá)。在酵母中獲得高效表達(dá)的外源基因往往都是酵母偏愛密碼子所編碼的基因, 通過對酵母基因使用密碼子的統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)所有的61個(gè)密碼子中有25個(gè)是酵母所偏愛的, 因此對密碼子進(jìn)行偏愛性改造能大量提高重組蛋白在該系統(tǒng)中的表達(dá)量[6]。

本研究旨在嘗試通過密碼子優(yōu)化提高N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶基因aiiaB546在畢赤酵母中的表達(dá)活性。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

大腸桿菌 (Escherichia coli) DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司, 表達(dá)菌株畢赤酵母GS115和表達(dá)載體pPIC9購自Invitrogen公司, KYC55指示菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 其他材料

方格紙：邊長為18 cm的正方形紙上排列22個(gè)長方形, 每個(gè)長方形的長為15個(gè)小方格, 寬為2個(gè)小方格, 每個(gè)小方格為邊長4 mm。

ATmm鹽溶液：KH2PO40.079 mol/L, NaOH 0.044 mol/L, (NH4)2SO40.015 mol/L, MgSO4·7H2O 0.6mmol/L, CaCl20.06 mmol/L, FeSO4·7H2O 0.027 mmol/L, MnSO4·H2O 0.007 mmol/L。

ATmm固體培養(yǎng)基：葡萄糖0.75 g,瓊脂粉3 g,超純水138 g,滅菌冷卻后加入ATmm鹽溶液15 mL, X-gal溶液200 μL。

3-oxo-C8-HSL購自Sigma公司, 內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司, T4連接酶為NEB公司產(chǎn)品。

1.3 基因aiiaB546M的設(shè)計(jì)改造及全合成

根據(jù)酵母密碼子偏好性[6], 對高絲氨酸內(nèi)酯酶成熟肽段的編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化, 并且使GC含量保持適中。優(yōu)化后的序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行全合成, 并與pUC57載體連接。

1.4 aiiaB546M- pPIC9表達(dá)載體的構(gòu)建

小量提取質(zhì)粒aiiaB546M-pUC57和質(zhì)粒pPIC9, 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切, 電泳后回收aiiaB546M連接到同樣進(jìn)行雙酶切的空載體pPIC9中, 將連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, AOX通用引物驗(yàn)證、測序、獲得重組載體aiiaB546M-pPIC9, 經(jīng)BglⅡ酶切后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞, 涂布MD平板。

1.5 目的基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)

挑取200個(gè)單克隆接種于3 mLBMGY培養(yǎng)液中, 30℃振蕩培養(yǎng)48h; 3250 r/min離心5min去上清, 加入1 mLBMMY培養(yǎng)液誘導(dǎo)48h。將培養(yǎng)液10000 r/m離心5min, 收集上清液, 檢測N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶活性,選擇有活性的菌株進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證, 正確后篩選酶活最高的陽性重組子。

1.6 陽性重組子中N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性的檢測

按照參考文獻(xiàn)[4], 采用瓊脂平板擴(kuò)散法檢測N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶活力, 取20 μL蛋白液加入179 μL 0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH8.0)和1μL 1mg/mL的3-oxo-C8-HSL混合搖勻, 30℃溫育30min后, 加入50 μL 10% SDS水溶液終止反應(yīng)得到反應(yīng)液, 對照液為反應(yīng)終止后再加入20 μL熱滅活酶液。取10 μL反應(yīng)液(對照液)滴至膠條上, 30℃培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)變藍(lán)點(diǎn)數(shù), 計(jì)算距離, 按酶活計(jì)算公式計(jì)算待測溶液的酶活。

1.7 密碼子優(yōu)化前后表達(dá)水平及酶活力的比較

按照1.5所述的方法, 將未進(jìn)行密碼子優(yōu)化的原基因aiiaB546連接pPIC9載體后, 轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞, 挑取200個(gè)單克隆, 誘導(dǎo)后選擇酶活最高的菌株為對照, 與改造后的重組菌株在相同條件(接種量、培養(yǎng)及誘導(dǎo)時(shí)間、儀器設(shè)備)下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá), 通過考馬斯亮藍(lán)法測定兩組樣品酶液中的蛋白含量, 比較二者的酶活力, 重復(fù)三次取平均值。SPSS 11.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析, 顯著性臨界值設(shè)定0.05。

2 結(jié)果

2.1 aiiaB546M基因的全合成

aiiaB546M基因成熟肽編碼序列全長753 bp, 密碼子優(yōu)化時(shí), 在氨基酸序列保持不變的前提下, 共改變了155個(gè)堿基, GC含量由45.18%下降到41.38%, 基本符合畢赤酵母GC含量特征[6](圖1)?；蚝铣珊罂寺〉捷d體pUC57上, 得到重組質(zhì)粒aiiaB546M-pUC57。

2.2 含aiiaB546M基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建

載體pPIC9和重組質(zhì)粒aiiaB546M-pUC57都用EcoRⅠ和Not Ⅰ雙酶切(圖2), 回收后連接, 得到重組畢赤酵母表達(dá)載體aiiaB546M- pPIC9。

2.3 表達(dá)N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的重組畢赤酵母菌株的

篩選

aiiaB546M- pPIC9經(jīng)BglII酶切后, 電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株, 按1.5和1.6所述方法篩選得到高效表達(dá)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的重組畢赤酵母GS115-aiiaB546M,每個(gè)重組菌株設(shè)兩個(gè)平行(圖3)。

2.4 密碼子優(yōu)化前后蛋白濃度及酶活力的比較

經(jīng)測定, 密碼子優(yōu)化前后N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的蛋白濃度分別為1.37 mg/mL和1.54 mg/mL, 酶活力分別為33.1 U/mL和36.2 U/mL, 可以看出經(jīng)密碼子優(yōu)化后,蛋白表達(dá)量提高了12.4% (*P<0.05), 酶活性提高了9.5% (*P<0.05)。

3 討論

高效表達(dá)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶是進(jìn)一步提高該酶發(fā)酵效價(jià)、降低生產(chǎn)成本的新的有效途徑。來源于Bacillus的AiiaB546是迄今所報(bào)道的首次可以在畢赤酵母中表達(dá)的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶, 且具有很好的熱穩(wěn)定性、金屬離子抗性及抗蛋白酶降解能力, 經(jīng)畢赤酵母表達(dá)的該酶和嗜水氣單胞菌共注射錦鯉可以較明顯地降低錦鯉死亡率和延遲半數(shù)致死時(shí)間, 而只注射該N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶對錦鯉無害[3]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖防治嗜水氣單胞菌引起的疾病中, 注射或潛在的飼喂N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶可能成為一種替代抗生素的方法[7]。本文將aiiaB546基因進(jìn)行改造后在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá), 搖瓶誘導(dǎo)條件下的最高酶活力達(dá)到36.2 U/mL, 而相同條件下原基因(aiiaB546)重組質(zhì)粒aiiaB546-pPIC9轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115重組菌的酶活力為33.1 U/mL, 顯然經(jīng)密碼子優(yōu)化后, 該酶在搖瓶水平的表達(dá)活性有了明顯提高, 但仍需進(jìn)行小試及中試發(fā)酵水平的驗(yàn)證以確認(rèn)此改善幅度的實(shí)際價(jià)值。

圖1 密碼子優(yōu)化前后基因的比對Fig. 1 The gene before and after codon optimization

圖2 雙酶切后的aiiaB546M基因和pPIC9載體Fig. 2 The gene aiiaB546M and vector pPIC9 after digestion with EcoRI and NotI

根據(jù)表達(dá)宿主的密碼子偏愛性對外源基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化, 是提高外源基因表達(dá)量的一種有效方法[8,9], 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在密碼子使用上的偏愛性在翻譯水平影響外源基因的表達(dá), 尤其是稀有密碼子密集區(qū)往往成為制約翻譯速率及表達(dá)水平的因素。本研究將aiiaB546基因中所有低偏愛性密碼子及大部分中等偏愛性密碼子替換為高偏愛性密碼子, 使其在畢赤酵母中的表達(dá)量與活性分別較優(yōu)化前提高了12.4%和9.53%。

圖3 重組畢赤酵母GS115-aiiaB546M高酶活菌株的篩選Fig. 3 Screen of recombinant GS115-aiiaB546Mstrain with high enzyme activity

另外, 增加外源基因在畢赤酵母染色體上整合的拷貝數(shù)也是提高外源蛋白表達(dá)量的有效方式[10], 本研究室正在對N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶進(jìn)行這方面的嘗試。

[1] Zhang L Q, Tian T, Mei G Y. Quorum Quenching, a new strategy for controlling plant bacterial diseases [J]. Chinese Journal of Biological Control, 2008, 26(23): 241—247 [張力群, 田濤, 梅桂英. 群體感應(yīng)淬滅——防治子午細(xì)菌病害的新策略. 中國生物防治, 2008, 26(23): 241—247]

[2] Gu X G, Wang Q J, Xu X C. Poultry intestinal health and disease control [J]. Feed Review(Technology), 2010, 84(8): 41—43 [辜新貴, 王啟軍, 許小成. 家禽腸道健康和疾病控制. 飼料博覽(技術(shù)版), 2010, 84(8): 41—43]

[3] Chen R D, Zhou Z G, Cao Y N, et al. High yield expression of an AHL-lactonase from Bacillus sp. B546 in Pichia pastoris and its application to reduce Aeromonas hydrophila mortality in aquaculture [J]. Microbial Cell Factories, 2010, 39(9): 2—10

[4] Zhang M C, Cao Y N, Yao B, et al. High expression and characterization of N-acyl-homoserinelactonase-xylanase recombinant protein [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2011, 51(8): 1052—1061 [張美超, 曹雅男, 姚斌, 等.高效表達(dá)N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其酶學(xué)性質(zhì).微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(8): 1052—1061]

[5] Zhang M C, Cao Y N, Yao B, et al. Characteristics of quenching enzyme AiiO-AIO6 and its effect on Aeromonas hydrophila virulence factors expression [J]. Journal of Fisheries of China, 2011, 35(11): 1720—1728 [張美超, 曹雅男,姚斌, 等. 淬滅酶AiiO-AIO6酶學(xué)性質(zhì)及對嗜水氣單胞菌毒力因子的表達(dá)調(diào)控. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(11): 1720—1728]

[6] Zhao X, Huo K K, Li Y Y. Synonymous codon usage in Pichia pastoris [J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16(3): 308—311

[7] Li X H, Shen J Y, Shen Z H, et al. Immunity and immunohistochemistry by oral vaccination of carassius a uratus gibelio using Aeromonas hydrophila vaccine [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2007, 31(1): 125—130 [李新華, 沈錦玉,沈智華, 等. 銀鯽口服嗜水氣單胞菌疫苗的免疫和免疫組化研究. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31(1): 125—130]

[8] Cid Arregui, Juarez V, ZurHausen H. A synthetic E7 gene of human papillomacirus type 16 yields enhanced expression of the protein mammali cells and is useful for DNA immunization studies [J]. Journal of Virology, 2003, 77(8): 4928—4937

[9] Yadava A, Ockenhouse C F. Effect of codon optimization on expression levels of a functionally folded malaria vaccine candidate in prokaryotic and eukaryotic expression systems [J]. Infection and Immunity, 2003, 71(9): 4961—4969

[10] Vassileva A, Chugh D A, Swaminathan S, et a1. Effect of copy number on the expression levels of hepatitis Bsurface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris [J]. Protein Expression and Purification, 2001, 21(1): 71—80

THE N-ACYL-HOMOSERINELACTONASE-XYLANASEGENE AIIAB546 REACHED A HIGHER EXPRESSION LEVEL BY CODON OPITIMIZATION IN PICHIAPASTORIS

ZHANG Yu-Ting1, CAO Ya-Nan1, XIE Shou-Qi2and ZHOU Zhi-Gang1
(1. Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, State Key Laboratory for Freshwater Ecology and Biotechnology, Wuhan 430072, China)

N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶; 密碼子優(yōu)化; 酵母表達(dá)

N-acyl-homoserinelactonase; Codon optimization; Yeast expression

Q786

A

1000-3207(2013)01-0164-04

10.7541/2013.164

2011-12-20;

2012-11-01

十二五國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD25B00); 天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目(201004040); 北京市鱘魚、鮭鱒魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系; 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(2011FB05)資助

張宇婷(1986—), 女, 內(nèi)蒙古呼和浩特人; 碩士研究生; 主要從事水產(chǎn)微生物基因工程研究。E-mail: zhangyt_1986@ sina.com

周志剛, E-mail: zhou_zg@msn.com