汪春建 朱冬發(fā) 亓一舟 胡則輝 謝 熙 沈 潔

(寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211)

三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因mRNA水平與蛻皮激素濃度變化

汪春建 朱冬發(fā) 亓一舟 胡則輝 謝 熙 沈 潔

(寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211)

甲殼動(dòng)物的蛻皮過程被認(rèn)為是由位于眼柄的X器-竇腺復(fù)合體(XO-SG)分泌蛻皮抑制激素(MIH)通過調(diào)節(jié)Y器(YO)合成蛻皮激素而調(diào)控的。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)發(fā)現(xiàn)MIH基因在三疣梭子蟹眼柄X器-竇腺復(fù)合體中表達(dá)最強(qiáng)。采用qRT-PCR分析了MIH基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達(dá)變化, 結(jié)果表明; A期為(0.42±0.08)倍, B期為(1.09±0.09)倍, C期為(1.35±0.16)倍, D0亞期為(1.00±0.10)倍, D1亞期(0.78±0.07)倍, D2亞期為(0.27±0.08)倍, D3/4亞期為(0.20±0.04)倍。采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法完成了三疣梭子蟹蛻皮周期中蛻皮激素(20E)濃度變化的測定。A/B期蛻皮激素的濃度較低,低于儀器檢測限0.33 pg, C期為(1.666±0.762) ng/mL, D0亞期為(4.047±1.5133) ng/mL, D1亞期為(6.756±4.928) ng/mL, D2亞期為(8.609±3.827) ng/mL, D3亞期為(19.534±4.799) ng/mL, D4亞期為11.616 ng/mL。在三疣梭子蟹蛻皮周期中, MIH基因表達(dá)量與血淋巴中蛻皮激素濃度呈現(xiàn)一定拮抗性, 揭示MIH抑制Y器合成蛻皮激素而調(diào)控著三疣梭子蟹蛻皮的發(fā)生和進(jìn)行。

三疣梭子蟹; 蛻皮周期; 蛻皮抑制激素; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜

蛻皮是甲殼動(dòng)物蛻去舊的外骨骼并長出新的外骨骼的過程, 是甲殼動(dòng)物生長和發(fā)育的標(biāo)志特征,它貫穿甲殼動(dòng)物個(gè)體發(fā)育的始終, 受神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)[1]。甲殼動(dòng)物的蛻皮被認(rèn)為是由位于眼柄的X器-竇腺復(fù)合體(X-organ–sinus gland, XO-SG)分泌的MIH (Molt-inhibiting hormone, MIH)通過調(diào)節(jié)Y-器(Y-organ, YO)蛻皮激素的合成而調(diào)控的[2—4]。MIH是在甲殼動(dòng)物眼柄中的X-器(X-organ, XO)中合成, 并在神經(jīng)血器官即竇腺(Sinus gland, SG)中儲(chǔ)存和釋放[5]。一般認(rèn)為在切除甲殼類動(dòng)物眼柄后能有效促進(jìn)蛻殼和性腺的早期發(fā)育; 對切除眼柄的動(dòng)物重新注入眼柄分泌物或合成的MIH后, 血淋巴蛻皮激素濃度就會(huì)降低, 同時(shí)蛻皮也會(huì)推遲; 只有當(dāng)MIH的分泌量減少或停止時(shí)蛻皮才會(huì)發(fā)生[6,7]。故普遍接受甲殼動(dòng)物MIH抑制Y器合成蛻皮激素的蛻皮調(diào)控理論模式[8,9]。可口美青蟹(Calilnectes sapidus)和凡納濱對蝦(Litopenaeus vanname)蛻皮周期中MIH表達(dá)量與血淋巴中蛻皮激素濃度呈現(xiàn)一定拮抗性[10,11], 符合MIH抑制Y器合成蛻皮激素的蛻皮調(diào)控理論模式[8,9]。但是, 有研究報(bào)道克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)和三葉真蟹(Carcinus maenas)在蛻皮周期中MIH表達(dá)量和血淋巴中蛻皮激素濃度不完全拮抗, 與普遍接受的蛻皮調(diào)控理論相違背[12,13]。由此可知, 甲殼動(dòng)物蛻皮調(diào)控理論的完善需要更廣泛更深入的研究[14]。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國重要經(jīng)濟(jì)蟹類之一。人工養(yǎng)殖的三疣梭子蟹與中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)一樣, 存在性早熟和蛻皮未遂等問題[15]。這些問題的解決有賴于甲殼類動(dòng)物蛻皮調(diào)控機(jī)制的闡明[16]。在克隆獲得了三疣梭子蟹MIH基因全長cDNA序列[17]和采用形態(tài)觀察法對三疣梭子蟹蛻皮周期進(jìn)行細(xì)致分期[18]的基礎(chǔ)上, 我們進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)分析了三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因mRNA水平變化; 采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(High performance liquid chromatography-e1ectrospray ionization tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)法測定了三疣梭子蟹蛻皮周期中蛻皮激素(20-羥基蛻皮酮)(20-hydroxyecdysone, 20E)濃度變化, 為深入探討三疣梭子蟹蛻皮調(diào)控機(jī)制和在生產(chǎn)上控制三疣梭子蟹蛻皮和生長奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與預(yù)處理

選取頭胸甲寬(CW)為8—12 cm、體重(BW)為45—80 g的野生三疣梭子蟹, 暫養(yǎng)于寧波市寧?？h得水育苗場。采用形態(tài)觀察法將三疣梭子蟹蛻皮周期劃分為蛻皮后期(A期和B期), 蛻皮間期(C期),蛻皮前期(D0、D1、D2、D3和D4亞期)和蛻皮期(E期)四個(gè)階段[18]。采集C期三疣梭子蟹眼柄X器-竇腺復(fù)合體、胸神經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢、腸、腦、Y器和肝胰腺用于組織表達(dá)差異分析。采集A期、B期、C期、D0亞期、D1亞期、D2亞期和D3/4亞期三疣梭子蟹眼柄X器-竇腺復(fù)合體(液氮保存)用于蛻皮周期中MIH基因表達(dá)水平變化測定。采集A期、B期、C期、D0亞期、D1亞期、D2亞期、D3亞期和D4亞期各300 μL血淋巴。預(yù)處理過程包括: 在采集的300 μL血淋巴加入1200 μL乙腈和20 μL 100 ng/mL高油菜素內(nèi)酯, 輕微渦旋震蕩; 8500 r/min, 離心15min;吸取上清液1 mL至另外1.5 mL離心管中; ?20℃保存, 用于蛻皮激素濃度測定。

1.2 主要試劑

DEPC, Trizol購自Sangon公司(上海); DNase I(RNase Free), PrimeScript RT reagent Kit, SYBR Premix Ex Taq II試劑盒均購自Takara公司(日本); 20-羥基蛻皮酮和高油菜素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%),乙酸(色譜純)購自SIGMA-ALDRICH公司(美國);乙腈(色譜純)購自TEDIA公司(美國); 引物合成及測序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)完成。

1.3 方法

總RNA提取 按Trizol試劑說明書提取各個(gè)樣品中的Total RNA, 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性, 紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度分析。提取Total RNA后, 再使用DNase I分解混入的基因組DNA,最后進(jìn)行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等純化Total RNA。

第一鏈cDNA合成 每個(gè)Total RNA樣品取1.0 μg, 5×PrimeScript Buffer 2 μL, PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL, Oligo (dT) Primer (50 μmol/L) 0.5 μL, Random 6 mers (100 μmol/L) 0.5 μL, 最后用RNase Free dH2O補(bǔ)足10 μL。引物序列及具體操作參照PrimeScript RT reagent Kit說明書。

qRT-PCR qRT-PCR在Mastercycler ep realplex real-time PCR (Eppendorf)上完成, 25 μL定量PCR反應(yīng)體系包括; SYBR Premix Ex Taq II (2×)緩沖液 12.5 μL, 正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL(表1), cDNA模板 1 μL, dH2O 10.5 μL。程序采用三步法; 先95℃ 30s (1 cycle); 隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán),每一循環(huán)包括95℃ 15s, 55℃ 30s, 68℃ 30s, 收集熒光信號; 40個(gè)循環(huán)結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析, 確保特異性擴(kuò)增, 95℃ 30 s, 55℃ 30s, 95℃15s(1 cycle), 55—95℃, +0.5℃/cycle, 收集熒光信號。

18S rRNA 將三疣梭子蟹不同組織和蛻皮周期中的cDNA樣本按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件擴(kuò)增, 測定各個(gè)樣品的內(nèi)參基因18S rRNA Ct值。在http://medgen.ugent.be/ ～jvdesomp/genorm/網(wǎng)站下載geNorm程序, 并對18S rRNA內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 計(jì)算出基因表達(dá)穩(wěn)定性的平均值M和配對變異度V, 通常建議M<1.5, V<0.15為選擇閾值, 認(rèn)為內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性較好[19,20]。同時(shí)進(jìn)一步采用2?ΔCt[ΔCt=(Cttimex?Cttime0)]法[21,22]分析內(nèi)參基因18S rRNA表達(dá)水平。

相對定量 采用根據(jù)Livak, et al[22]提出的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法2???Ct[ΔΔCt=(Ct目的基因?Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組?(Ct目的基因?Ct管家基因)]對照組, 18S rRNA做內(nèi)參基因;三次生物學(xué)重復(fù), 每個(gè)生物學(xué)重復(fù)分析三次]對相對定量的結(jié)果進(jìn)行分析, 獲得三疣梭子蟹蛻皮不同組織與周期中MIH基因mRNA的相對表達(dá)量。

蛻皮激素濃度測定 血淋巴中蛻皮激素濃度測定在TSQ Quantum Access液相色譜一三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Finnigan)上完成, 具體操作參照趙鵬等[23]報(bào)道高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜分析海洋甲殼動(dòng)物淋巴和肌肉中的20-羥基蛻皮酮(20E)。

數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。顯著性差異用SPSS軟件(13.0)中的單因素(One-wayANOVA)方差進(jìn)行分析, 以P < 0.05為顯著性差異, P < 0.01為極顯著性差異。

表1 內(nèi)參基因與目的基因的引物序列Tab. 1 Primer sequences for internal control genes and targeted genes

2 結(jié)果

2.1 18S rRNA基因表達(dá)穩(wěn)定性的檢測

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了三疣梭子蟹8個(gè)不同組織: 眼柄X器-竇腺復(fù)合體、胸神經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢、腸、腦、Y器和肝胰腺; 7個(gè)蛻皮階段; A期、B期、C期、D0亞期、D1亞期、D2亞期和D3/4亞期眼柄X器-竇腺復(fù)合體中的18S rRNA表達(dá)水平。本文測得18S rRNA基因在8個(gè)不同組織中的M值為0.762, V值為0.082; 在7個(gè)蛻皮階段中的M值為0.437, V值為0.049, 因此18S rRNA基因在本實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)水平穩(wěn)定性較好。以眼柄X器-竇腺復(fù)合體為對照組(Cttime0), 采用2?ΔCt法計(jì)算另外各個(gè)組織(Cttimex)中的18S rRNA相對表達(dá)量(圖1)。

圖1 三疣梭子蟹8個(gè)不同組織中18S rRNA的表達(dá)水平(P>0.05)Fig. 1 Expression levels of 18S rRNA in eight different tissues of P. trituberculatus. The differences were considered as not significant (P>0.05)

同樣以D0亞期為對照組, 采用2?ΔCt法計(jì)算另外各個(gè)蛻皮階段中的18S rRNA相對表達(dá)量(圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 三疣梭子蟹8個(gè)不同組織和7個(gè)蛻皮階段中的18S rRNA表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。

圖2 三疣梭子蟹7個(gè)蛻皮階段中18S rRNA的表達(dá)水平(P>0.05)Fig. 2 Expression levels of 18S rRNA in seven molting stages of P. trituberculatus. Differences were considered as not significant (P>0.05)

2.2 MIH基因組織表達(dá)的相對定量

以18S rRNA做內(nèi)參基因, 對MIH基因在眼柄X器-竇腺復(fù)合體、胸神經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢、腸、腦、Y器、肝胰腺等8個(gè)組織中的表達(dá)差異進(jìn)行了qRTPCR分析。以眼柄X器-竇腺復(fù)合體為對照組, 采用2?ΔΔCt方法計(jì)算另外各個(gè)組織中的MIH mRNA相對表達(dá)量, 結(jié)果顯示: 眼柄X器-竇腺復(fù)合體為(1±0.09)倍;胸神經(jīng)節(jié)為(0.072±0.011)倍; 精巢為(0.012±0.0023)倍; 卵巢為(0.0018±0.00075)倍; 腦為(0.0026±0.00098)倍; 腸為(0.0034±0.00033)倍; Y器為(0.00023± 0.000083)倍; 肝胰腺為(0.00018±0.000023)倍(圖3)。

圖3 三疣梭子蟹各個(gè)組織MIH基因mRNA相對表達(dá)量[ “**”為極顯著性差異(P < 0.01)]Fig. 3 Relative quantitative expression of MIH mRNA in various tissues from P. trituberculatus [Values with “**” indicate significant differences (P < 0.01)]

由此可見MIH基因在三疣梭子蟹眼柄X器-竇腺復(fù)合體中表達(dá)最強(qiáng), 且與其余組織相比差異性極顯著(P < 0.01), 胸神經(jīng)節(jié)表達(dá)次之, 其他組織表達(dá)量均極低。

2.3 蛻皮周期中MIH基因 mRNA水平

由于MIH基因在三疣梭子蟹眼柄X器-竇腺復(fù)合體中表達(dá)最強(qiáng), 故以蛻皮周期中各個(gè)時(shí)期的眼柄X器-竇腺復(fù)合體為材料進(jìn)行qRT-PCR分析。用18S rRNA做內(nèi)參基因, 以D0亞期為對照, 采用2?ΔΔCt方法計(jì)算其他各期MIH基因mRNA相對表達(dá)量, 結(jié)果顯示: A期為(0.42±0.08)倍; B期為(1.09±0.09)倍; C期為(1.35±0.16)倍; D0亞期為(1.00±0.10)倍; D1亞期(0.78±0.07)倍; D2亞期為(0.27±0.08)倍; D3/4亞期為(0.20±0.04)倍(圖4)。MIH表達(dá)量最高的C期與最低的D3/4亞期相差將近7倍。LSD檢驗(yàn)法分析顯示,除D2亞期與D3/4亞期間差異不顯著外, 蛻皮周期中各個(gè)時(shí)期的MIH基因表達(dá)量間均有顯著性差異(P<0.05)。在三疣梭子蟹整個(gè)蛻皮周期中, MIH基因表達(dá)水平呈一個(gè)明顯的變化規(guī)律: MIH表達(dá)量從A期開始上升, 到C期達(dá)到頂峰, 然后逐漸下降, 至下一次蛻皮前D3/4亞期達(dá)到最低, 完成一個(gè)蛻皮周期。

圖4 三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因表達(dá)水平變化的qRTPCR分析Fig. 4 qRT-PCR analysis of MIH mRNA levels during the molt cycle of P. trituberculatus and data were analyzed by LSD

2.4 蛻皮周期中蛻皮激素濃度變化

采用LC-MS/MS法完成三疣梭子蟹蛻皮周期中血淋巴蛻皮激素(20E)濃度變化的測定。隨著蛻皮周期的運(yùn)行, 血淋巴蛻皮激素濃度基本處于逐漸升高的趨勢, A/B期蛻皮激素的濃度低于儀器檢測限0.33 pg。C期蛻皮激素的濃度為(1.666±0.762) ng/mL。進(jìn)入蛻皮前期蛻皮激素濃度逐漸上升, D0、D1、D2亞期其濃度分別為(4.047±1.5133)、(6.756±4.928)和(8.609±3.827) ng/mL; 在D3亞期達(dá)到最高峰(19.534 ± 4.799) ng/mL, D4亞期回落為11.616 ng/mL (圖5)。

圖5 LC-MS/MS法測定三疣梭子蟹蛻皮周期中蛻皮激素(20E)濃度變化Fig. 5 Ecdysteroids (20E) in the hemolymph of individual crabs were quantified by LC-MS/MS, and data were analyzed by LSD

3 討論

本文分析了MIH基因在三疣梭子蟹8個(gè)不同組織中的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示, MIH基因在眼柄X器-竇腺復(fù)合體中表達(dá)量最高, 遠(yuǎn)高于其他組織; 其次是胸神經(jīng)節(jié), 再次是精巢, 其余組織中MIH表達(dá)量均極低 (圖3)。這表明MIH基因在三疣梭子蟹眼柄X器-竇腺復(fù)合體中表達(dá)最強(qiáng), 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持眼柄X器-竇腺復(fù)合體分泌MIH抑制Y器合成蛻皮激素的調(diào)控觀點(diǎn)[8,9], 為進(jìn)一步精確分析三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因表達(dá)水平變化打下了良好的基礎(chǔ)。邱高峰等[24]采用RNA點(diǎn)雜交檢測鋸緣青蟹(Scylla serrata) MIH在不同組織中的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)MIH僅在眼柄X器-竇腺復(fù)合體和腦中表達(dá); Chen, et al.[11]采用半定量方法分析凡納濱對蝦(L. vanname)2種MIH (Liv-MIH1和Liv-MIH2)的組織表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)MIH僅在眼柄X器-竇腺復(fù)合體中表達(dá); 孫妍等[25]采用半定量RT-PCR和Northen blot分析了中華絨螯蟹(E. sinensis) MIH在不同組織中的表達(dá), 也發(fā)現(xiàn)MIH僅在眼柄X器-竇腺復(fù)合體中表達(dá)。比較而言, qRT-PCR為檢測低豐度mRNA提供更便利和科學(xué)的方法[19—22],具有準(zhǔn)確、靈敏、簡便等優(yōu)點(diǎn)。這可能是我們能檢測到眼柄X器-竇腺復(fù)合體MIH基因高表達(dá)以外,也檢測到其余組織中MIH基因表達(dá)的原因。

本文發(fā)現(xiàn)在三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH表達(dá)水平呈一個(gè)明顯的規(guī)律: MIH表達(dá)量從蛻皮后期(A期)開始上升, 到蛻皮間期(C期)達(dá)到頂峰, 然后逐漸下降, 至下一個(gè)蛻皮前期(D3/4亞期)達(dá)到最低, 啟動(dòng)新的蛻皮過程(圖4)。同時(shí)分析了三疣梭子蟹蛻皮周期中血淋巴蛻皮激素(20E)濃度變化趨勢: 蛻皮后期(A期和B期)均檢測不到蛻皮激素, 蛻皮間期(C期)開始上升, 到蛻皮前期(D3亞期)期達(dá)到頂峰, 蛻皮前期(D4亞期)出現(xiàn)回落(圖5)。三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH表達(dá)水平變化趨勢與血淋巴中蛻皮激素濃度變化趨勢呈現(xiàn)一定拮抗性, 這與已報(bào)道的文獻(xiàn)相吻合[10,11]。這表明三疣梭子蟹蛻皮調(diào)控模式與甲殼動(dòng)物中普遍接受MIH抑制Y器合成蛻皮激素的蛻皮調(diào)控觀點(diǎn)基本一致[8,9], 眼柄X器-竇腺復(fù)合體分泌MIH抑制Y器合成蛻皮激素調(diào)控著三疣梭子蟹蛻皮發(fā)生和進(jìn)行。

蛻皮后期(A期)至蛻皮間期(C期)三疣梭子蟹眼柄X器-竇腺復(fù)合體MIH表達(dá)量呈顯著上升趨勢(圖4); 而蛻皮后期(A期和B期)血淋巴中蛻皮激素(20E)濃度低于儀器檢測限, 進(jìn)入蛻皮間期(C期), 蛻皮激素的濃度顯著上升。Lee, et al.[10]報(bào)道可口美青蟹(C. sapidus)眼柄X器-竇腺復(fù)合體MIH表達(dá)量在蛻皮后期(A/B期)至蛻皮間期(C期)一直處于高水平, 檢測到血淋巴中蛻皮激素濃度一直處于低水平。這可能源于種間差異, 更可能由于我們將蛻皮后期細(xì)分為A期和B期并分別采樣, 而后者把A期和B期合成A/B期進(jìn)行采樣所造成的。A期MIH表達(dá)量不到B期一半, 我們推測蛻皮后期(A期, 即軟殼期)為眼柄X器-竇腺復(fù)合體合成, 分泌MIH活動(dòng)處于調(diào)整的恢復(fù)期。血淋巴中蛻皮激素濃度的差異, 我們推測蛻皮后期(A期, 即軟殼期; B期, 即薄殼期) 蟹體含水量較高[18]導(dǎo)致檢測不到蛻皮激素; 蛻皮間期(C期,即硬殼期)蟹體含水量下降, 身體各個(gè)部位甲殼的全部硬化[18], 故能檢測到蛻皮激素。

蛻皮前期三疣梭子蟹眼柄X器-竇腺復(fù)合體MIH基因表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢 (圖4); 血淋巴中蛻皮激素濃度則呈逐漸上升趨勢, 僅蛻皮前期(D4亞期)出現(xiàn)下調(diào)(圖5), 二者表現(xiàn)較強(qiáng)的拮抗作用。這一結(jié)果與Lee, et al.[10]研究報(bào)道一致, 他們也發(fā)現(xiàn)可口美青蟹(C. sapidus) 蛻皮激素濃度在蛻皮前期(D4亞期)出現(xiàn)下調(diào), 而不符合拮抗理論, 并推測可能原因: (1) 蛻皮過程主要是由血淋巴中MIH神經(jīng)肽與蛻皮激素相互調(diào)節(jié)而調(diào)控的, 而血淋巴中MIH神經(jīng)肽濃度滯后眼柄X器-竇腺復(fù)合體MIH表達(dá)水平, MIH表達(dá)水平可能不能精確反映血淋巴MIH神經(jīng)肽濃度。(2) MIH并不是唯一的調(diào)控因子。目前已報(bào)道的參與蛻皮調(diào)控相關(guān)因子包括CHH、MOIH、cAMP、cGMP、FaMeT和Ca2+等, 這些調(diào)控相關(guān)因子都可能直接或間接調(diào)控Y器合成蛻皮激素[13,26—29]。

在整個(gè)蛻皮周期中三疣梭子蟹MIH基因表達(dá)量和血淋巴中蛻皮激素濃度呈現(xiàn)一個(gè)起伏波動(dòng)的變化規(guī)律并具有一定拮抗性, 這與已報(bào)道的文獻(xiàn)相一致[10,11]。但是, Ohira, et al.[30]分析了日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)蛻皮周期中眼柄X器-竇腺復(fù)合體MIH表達(dá)水平變化, 發(fā)現(xiàn)在整個(gè)蛻皮周期中MIH表達(dá)水平無顯著變化, 并提出MIH的合成以及分泌屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制這一假設(shè); Chung, et al.[13]報(bào)道了三葉真蟹(C. maenas) 蛻皮周期中眼柄X器-竇腺復(fù)合體MIH和CHH表達(dá)水平變化, 發(fā)現(xiàn)MIH表達(dá)量在蛻皮間期(C4)和蛻皮蛻皮前期(D2)也無顯著變化, 認(rèn)為CHH也參與蛻皮調(diào)控; Nakatsuji, et al.[12]在研究克氏螯蝦(P. clarkii) MIH表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)MIH表達(dá)量在蛻皮前期的中期和后期都增加了,且Y器蛻皮激素合成也同樣增加了, 分析認(rèn)為蛻皮前期的中期和后期Y器對MIH的應(yīng)答遲鈍, 故蛻皮的發(fā)生不僅僅是由MIH表達(dá)水平調(diào)控的, 且與Y器對MIH的應(yīng)答有關(guān)。根據(jù)我們得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道[10—13,30], 我們推測蝦蟹類蛻皮周期中MIH表達(dá)水平變化與蛻皮激素濃度變化趨勢是否具有起伏波動(dòng)性且呈現(xiàn)一定拮抗性作用可能不完全一致。我們認(rèn)為種間差異是一方面原因, 不是所有的蝦蟹類蛻皮調(diào)控理論都符合普遍接受的甲殼動(dòng)物蛻皮理論是另一方面原因。本研究為更廣泛和更深入地研究甲殼動(dòng)物蛻皮調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)資料, 為研究人工養(yǎng)殖三疣梭子蟹過程中, 解決性早熟和蛻皮未遂等問題提供了準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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MOLT-INHIBITING HORMONE LEVELS AND ECDYSTEROID TITER DURING A MOLT CYCLE OF PORTUNUS TRITUBERCULATUS

WANG Chun-Jian, ZHU Dong-Fa, QI Yi-Zhou, HU Ze-Hui, XIE Xi and SHEN Jie
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Portunus trituberculatus as a popular table delicacy is one of the most important fishery and aquaculture species of crab around the coast of China. In crustaceans, molt-inhibiting hormone (MIH), a polypeptide secreted by the X-organ–sinus gland (XO-SG) of the eyestalks, had been proposed to regulate molting by inhibiting the synthesis of ecdysteroids from Y-organs (YO). The method for determining the levels of MIH mRNA in the swimming crab had been developed using relative quantification of quantitative real-time PCR (qRT-PCR). We found the expression level of MIH mRNA was the highest in the XO-SG. By taking surstage D0as the control group, the levels of MIH mRNA were analyzed by 2?ΔΔCtin a molt cycle, and the results showed that MIH transcripts down-regulated 0.42±0.08, increased (1.09±0.09, increased 1.35±0.16 fold in stage A, B, C, respectively, and down-regulated 0.78±0.07, down-regulated 0.27±0.08, down-regulated 0.20±0.04 fold in surstage D1, D2, D3/4, respectively. In addition, we used the method of high performance liquid chromatography-e1ectrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to complete the process of measuring the consistency of portunus molting ecdysteroid (20-hydroxyecdysone, 20E) in hemolymph. The results showed that the consistency of ecdysone was below the instrument detection limit of 0.33 pg in the post molt stage (A/B). In the inter-molt period (C), the consistency of ecdysone gradually returned to (1.666±0.762) ng/mL. In the pre-molt ecdysteroid titer increased gradually to (4.047±1.5133), (6.756±4.928) and (8.609±3.827) ng/mL in surstage D0, D1and D2, respectively. The ecdysteroid titer increased steadily to a peak of (19.534±4.799) ng/mL in the surstage D3, then dropped to 11.616 ng/mL in surstage D4. These stage-specific expression changes in MIH mRNA levels were accompanied by significant fluctuations in hemolymph ecdysteroid titer. During a molt cycle of the swimming crab, the expression of MIH exhibited a negative correlation with ecdysone in hemolymph, and this correlationindicated that MIH regulated the occurrence and advance of molt by inhibiting the ecdysteroid synthesis from YO.

Portunus trituberculatus; Molt cycle; MIH; qRT-PCR; LC-MS/MS

Q344

A

1000-3207(2013)01-0022-07

10.7541/2013.22

2011-11-08;

2012-10-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(40976098); 國家科技富民強(qiáng)縣專項(xiàng)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(2011F012); 寧波市科技局科研項(xiàng)目(2012A610137, 2011B81003)資助

汪春建(1985—), 男, 浙江富陽人; 碩士研究生; 主要從事甲殼動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail: bluesnail330@163.com

朱冬發(fā), E-mail: zhudongfa@nbu.edu.cn