王紅權唐德約趙玉蓉王小娜金柏濤張 凱肖調義

(1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院, 長沙 410128; 2.大通湖天泓漁業(yè)股份有限公司, 益陽 413207)

牛膝多糖對草魚免疫和抗氧化功能的影響

王紅權1唐德約1趙玉蓉1王小娜1金柏濤1張 凱2肖調義1

(1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院, 長沙 410128; 2.大通湖天泓漁業(yè)股份有限公司, 益陽 413207)

為探討在飼料中添加牛膝多糖(ABP)對草魚免疫和抗氧化功能的影響, 選取平均體重(88.13±0.76) g的健康草魚375尾, 隨機分成5個處理, 即基礎飼料組、0.05 %、0.10 %、0.20 %、0.40 % ABP添加組, 每個處理3個重復, 每個重復25尾魚, 飼養(yǎng)65 d。結果表明, 在飼料中添加ABP對草魚頭腎體指數(shù)影響不顯著(P>0.05), 對脾體指數(shù)影響顯著(P<0.05), 與對照組相比, 0.05 %、0.10 %、0.20 %和0.40%添加組脾體指數(shù)分別增加6.29% (P>0.05)、28.00% (P<0.05)、9.14%(P>0.05)和13.14% (P>0.05); 血液中NBT陽性細胞數(shù)隨著ABP添加量的增加呈增加的趨勢, 但各組間差異不顯著(P>0.05); 在飼料中添加ABP對草魚血清白蛋白、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)含量和過氧化氫酶活影響不顯著(P>0.05), 顯著影響草魚血清總蛋白(TP)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、α-腫瘤壞死因子(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量(P<0.05)。與對照組相比, 0.40%添加組的TP和AKP分別增加24.64% (P<0.05)和33.56% (P<0.05); 0.20 %、0.40 %添加組的LZM活力分別增加34.97% (P<0.05)和31.21% (P<0.05), SOD活力分別增加27.28% (P<0.05)和22.41% (P<0.05); 飼料中隨著ABP添加劑量的增加, 各組血清ACP活性先增加后緩慢下降, MDA含量先下降后上升。與對照組相比, 0.20%、0.40 %添加組ACP活性分別增加15.33% (P<0.05)和11.10% (P<0.05), 0.05%、0.10 %、0.20 %及0.40%添加組MDA含量分別下降11.97% (P>0.05)、21.33% (P<0.05)、32.37% (P<0.05)和2.53% (P>0.05)。飼料中隨著ABP添加量的增加, 各組草魚血清TNF-α含量變化規(guī)律不明顯, 但與對照組相比, 0.20%添加組TNF-α含量顯著增加(P<0.05)。綜上所述, 在草魚基礎日糧中添加適量牛膝多糖可以提高草魚的免疫和抗氧化能力, 建議添加量為0.20%。

草魚; 牛膝多糖; 免疫功能; 抗氧化功能

現(xiàn)代高密度集約化養(yǎng)殖模式和生態(tài)環(huán)境的日趨惡化導致水產養(yǎng)殖動物病害滋生、養(yǎng)殖效益下降,嚴重阻礙了水產養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展, 通過提高水產動物免疫力來抵抗疾病的發(fā)生已成為目前研究的熱點。牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharide, ABP)是從莧科植物牛膝根中提取出的一種水溶性多糖。目前的研究結果顯示, ABP具有提高仔豬生長性能, 改善豬肉品質, 提高機體免疫功能[1,2], 抗腫瘤[3]、降糖和保護腎臟[4,5]、抗炎[6]、抗凝血[7]、保肝[8]、治療哮喘[9]、抗衰老、抗氧化[10]、調節(jié)腸道微生態(tài)[11]等生理活性, 但這些研究主要集中在小鼠等試驗動物、畜禽或體外, 在水產動物營養(yǎng)與免疫領域的研究尚屬空白。因此, 本試驗以草魚為研究對象, 在其基礎日糧中添加不同質量的ABP, 以期探討ABP對草魚免疫和抗氧化功能的影響, 為其在水產飼料中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛膝多糖(是牛膝根的醇沉水提物, 經(jīng)測定多糖含量為50%), 購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。

草魚, 由大通湖天泓漁業(yè)股份有限公司漁場提供。

試驗飼料, 根據(jù)草魚配合飼料營養(yǎng)標準(SC/T 1024-1997)配制基礎飼料, 其配方及營養(yǎng)成分見表1。試驗飼料為分別在基礎飼料中添加0%、0.05 %、0.10 %、0.20 %、0.40 %的牛膝多糖。所有飼料原料先粉碎至全部通過0.43 mm的篩, 然后按配方混合均勻, 制成直徑為2.0 mm的硬顆粒。

1.2 試驗設計

采用單因子試驗設計, 根據(jù)日糧處理因素不同,設5個處理, 即基礎飼料組、0.05 %、0.10 %、0.20 %、0.40 % ABP添加組。選取平均體重(88.13±0.76) g的健康草魚375尾, 隨機分入5個處理, 每個處理設三個重復, 每個重復放養(yǎng)25尾魚。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗前, 將所有試驗用魚集中馴養(yǎng)10d, 待其適應試驗環(huán)境和試驗飼料。試驗開始時將魚稱重分組, 根據(jù)體重調整至各組間差異不顯著(P>0.05),分別飼養(yǎng)于1 m×1 m×1 m網(wǎng)箱中, 為期65d。分別于每日上午8: 00和下午4: 00進行投喂, 日投喂量為魚體重的2%—4%, 觀察并記錄試驗魚的攝食及活動狀況。試驗期間, 不定期對網(wǎng)箱進行清洗, 盡量排除外界因素對試驗結果的干擾。

1.4 樣品采集和指標測定

飼養(yǎng)試驗結束后, 停食24 h, 以網(wǎng)箱為單位稱重, 然后每箱隨機取接近平均體重的魚3尾, 丁香油麻醉后尾靜脈采血。血液分為兩部分, 一部分用肝素鈉抗凝, 用于四唑氮藍(Nitroblue tetrazolium, NBT)陽性細胞數(shù)的測定; 另一部分4℃冰箱靜置2 h, 3 000 r/min離心30 min, 吸取上層血清于?80℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后分別于冰盤上解剖, 分離其脾臟、頭腎, 用4℃、0.65%生理鹽水洗去血液, 濾紙吸干水分, 稱重, 計算頭腎體指數(shù)和脾體指數(shù)。

頭腎體指數(shù)(Head Kidney Somatic Index, HKSI) (‰)=(頭腎濕重/魚體重)×1000

脾體指數(shù)(Spleen Somatic Index, SSI)(‰)=(脾臟濕重/魚體重)×1000

NBT陽性細胞數(shù)的測定, 參照Anderson, et al.[12]的方法: 每尾魚觀察計數(shù)6個視野, 取其平均值作為結果, 每處理檢測6尾魚。

溶菌酶 (Lysozyme, LZM) 活力的測定, 參見吳旋[13]的測定方法。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性采用鄰苯三酚自氧化法測定、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定、過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性采用紫外吸收法測定、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)活性采用化學比色法測定, 其試劑盒均購自南京建成生物工程研究所; 總蛋白(Total protein, TP)、白蛋白(Albumin, ALB)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)試劑盒購自深圳邁瑞生化試劑公司,借助BS-200全自動生化分析儀測定; α-腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1(Interleukin-1, IL-1)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)放射免疫分析藥盒購自北京華英生物研究所, 用GC-1200γ放射免疫計數(shù)器測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS(V8)統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析,經(jīng)單因子方差分析差異顯著的再利用LSD法進行多重比較, 所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示。

表1 基礎飼料配方及營養(yǎng)成分(風干基礎, %)Tab.1 Formulation and nutrition composition of the basal diet(Air-dry basis, %)

2 結果

2.1 牛膝多糖對草魚頭腎和脾臟體指數(shù)的影響

統(tǒng)計分析結果表明(表2), 在飼料中添加牛膝多糖對草魚頭腎體指數(shù)影響不顯著(P>0.05), 對草魚脾體指數(shù)有顯著的影響(P<0.05), 與對照組相比, 0.05 %、0.10 %、0.20 %、0.40 % ABP添加組草魚的脾體指數(shù)分別增加6.29%(P>0.05)、28.00%(P< 0.05)、9.14%(P>0.05)和13.14%(P>0.05)。

2.2 牛膝多糖對草魚血液NBT陽性細胞數(shù)的影響

統(tǒng)計分析結果表明(表3), 草魚血液中NBT陽性細胞數(shù)隨著牛膝多糖添加量的增加呈增加的趨勢,但各組間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 牛膝多糖對草魚血清免疫指標和抗氧化指標的影響

統(tǒng)計分析結果表明(表4), 飼料中添加ABP對草魚血清白蛋白、IL-1、IL-6含量和過氧化氫酶活影響不顯著(P>0.05), 對草魚血清TP、AKP、ACP、LZM、TNF-α、SOD及MDA含量影響顯著(P<0.05)。與對照組相比, 0.40 %添加組的TP和AKP顯著升高(P<0.05), 分別增加24.64%和33.56%; 飼料中隨著ABP添加劑量的增加, 各組血清ACP活性先增加后緩慢下降, 與對照組相比, 0.20%、0.40%添加組的ACP分別增加15.33%(P<0.05)和11.10%(P<0.05);飼料中添加0.20%、0.40%ABP顯著增加草魚血清LZM和SOD活力(P<0.05), 與對照組相比, LZM活力分別增加34.97%(P<0.05)和31.21(P<0.05), SOD活力分別增加27.28%(P<0.05)和22.41%(P<0.05);隨著飼料中ABP添加量的增加, 各組血清MDA含量先下降后上升, 與對照組相比, 0.05%、0.10%、0.20%及0.40%添加組草魚血清MDA含量分別下降11.97%(P>0.05)、21.33%(P<0.05)、32.37%(P<0.05)和2.53%(P>0.05)。隨著飼料中ABP添加量的增加, 各組草魚血清TNF-α含量變化規(guī)律不明顯, 但0.20%添加組TNF-α含量顯著高于對照組(P<0.05), 比對照組增加20.62%, 其他各組間TNF-α含量差異不顯著。

表2 牛膝多糖對草魚免疫器官指數(shù)的影響Tab.2 Effects of ABP on immune organs index of grass carp (‰)

表3 牛膝多糖對草魚血液NBT陽性細胞數(shù)量的影響Tab.3 Effects of ABP on NBT positive-cells in blood of grass carp

表4 牛膝多糖對草魚血清免疫指標和抗氧化指標的影響Tab.4 Effects of ABP on serum immune and antioxidant indexes of grass carp

3 討論

頭腎和脾臟是水產動物重要的免疫器官, 在免疫細胞生成和免疫應答反應中起重要作用。樸香淑等[14]研究認為中草藥免疫促進劑可以加速免疫組織細胞的增殖、分化和成熟, 從而升高魚類或其他動物的免疫器官重量, 增強機體免疫能力。劉紅柏等[15]研究表明, 茯苓多糖能顯著增加鯉魚的脾體指數(shù);林旋等[16]在基礎日糧中添加黃芪多糖, 結果顯示魚體免疫器官指數(shù)都有相應程度地提高。本試驗結果表明, 飼料中添加牛膝多糖對草魚的頭腎體指數(shù)影響不顯著(P>0.05), 但能增加其脾體指數(shù), 并且在0.10%添加時達到顯著水平(P<0.05)。這說明飼料中添加適量的牛膝多糖可以促進草魚免疫器官的生長發(fā)育, 從而增強其機體的免疫能力。

血液學指標是動物體生理學、病理學以及毒理學的重要指標, 常用來評價魚類健康、營養(yǎng)及對環(huán)境的適應。血清中的ALB和TP含量是機體吸收、合成及分解蛋白質營養(yǎng)狀況的標志性反映, 也是機體免疫水平的反映[17]。溶菌酶在引發(fā)和維持機體防御免疫的過程中起著重要的作用, 在機體免疫過程中除了溶解細菌細胞壁外, 還可誘導和調節(jié)其他免疫因子的合成與分泌[18]。酸性磷酸酶是溶酶體酶系的標志酶, 直接作用于磷酸基團的轉移, 參與能量轉化和信號傳導等, 有利于磷酸二腺苷和磷酸三腺苷的合成, 進而提高機體非特異性免疫水平和營養(yǎng)代謝水平[19]; 堿性磷酸酶是一種在堿性條件下具有較高活力的膜結合酶, 也是溶酶體的一部分, 在堿性介質中可通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞降解, 其活力高低與動物的生長速度與生產性能密切相關[20]。本研究結果表明, 在草魚飼料中添加適量的牛膝多糖, 可以有效地提高草魚血清TP含量和LZM、ACP、AKP活力, 其中TP含量在牛膝多糖添加量為0.40%時最高; LZM活力在牛膝多糖添加量為0.20%和0.40%時顯著高于對照組; ACP活力在牛膝多糖添加量為0.20%時效果最為顯著, AKP活力在添加量為0.40%時效果最為顯著。陳清華[1]研究也表明, 斷奶仔豬日糧中添加適宜水平的牛膝多糖能顯著提高仔豬血清AKP活力。這說明適宜的牛膝多糖可以通過顯著升高草魚血清TP含量,提高草魚血清LZM、ACP、AKP活力來提高其非特異性免疫能力。

TNF-α是一種重要的免疫調節(jié)因子, 主要由淋巴細胞和巨噬細胞分泌, 能激活巨噬細胞與中性粒細胞, 促進抗原活化和T、B淋巴細胞增殖分化, 促進某些細胞產生白細胞介素、干擾素以及TNF-α等細胞因子, 發(fā)揮重要的免疫促進作用[21]。IL-1和IL-6形成于免疫反應早期, 在機體免疫應激中起主導作用[22]。研究表明: 牛膝多糖及其衍生物能夠顯著誘導小鼠脾淋巴細胞產生IL-2和TNF-α, 極大地發(fā)揮其免疫促進作用[23]; 顯著誘導單核巨噬細胞TNF-α和IL-6的表達[24]; 顯著誘導斷奶仔豬外周血及脾淋巴細胞TNF-α、IL-1β和IL-6的表達, 顯著增加斷奶仔豬血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量[25]。本研究結果表明, 在草魚日糧中添加牛膝多糖并沒有顯著影響其血清中IL-1和IL-6的含量, 但飼料中ABP添加量為0.20%時, 受試草魚血清TNF-α含量顯著高于對照組。這說明飼料中添加適宜的牛膝多糖可通過促進動物細胞因子的表達來提高機體的特異性免疫, 從而增強機體的抗感染和抗病能力。

動物機體內存在一套完整有力的抗氧化系統(tǒng),其中包括酶類和非酶類清除機制。酶類系統(tǒng)主要包括SOD, GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)和CAT等。SOD是機體內重要的抗氧化酶之一, 在清除自由基(如O2?、-OH 等)、防止生物分子損傷等方面具有十分重要的作用[26]。本研究結果表明, 飼料中牛膝多糖的添加量為0.20%和0.40%時, 草魚血清的SOD總活力顯著升高, 并且以0.20%添加時作用效果最為顯著; 飼料中隨著牛膝多糖添加水平的增加, 草魚血清過氧化氫酶活力先增加后下降, 與對照組相比, 添加量為0.20%時效果達顯著水平。MDA是脂質過氧化物反應的最終產物, 其含量的變化能準確地反映出機體抗氧化能力的變化, 且在一定程度內呈負相關[27]。本研究結果顯示, 隨著飼料中ABP添加量的增加, 各組草魚血清MDA含量先下降后上升。與對照組相比, 添加量為0.20%時, 草魚血清MDA含量降低的效果最為顯著。這說明草魚飼料中添加適宜水平的ABP可以提高草魚的抗氧化功能,減輕自由基對機體的損傷。

4 結論

本研究結果表明, 在草魚基礎飼料中添加適量

的牛膝多糖, 可以促進草魚免疫器官的生長發(fā)育,提高草魚血清TP、TNF-α含量和AKP、ACP、LSZ、SOD及CAT酶活, 從而提高草魚的免疫功能和抗氧化功能。推薦草魚飼料中ABP的適宜添加水平為0.2%。

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EFFECTS OF DIETARY ACHYRANTHES BIDENTATA POLYSACCHARIDE ON IMMUNITY AND ANTIOXIDANT FUNCTION OF GRASS CARP CTENOPHARYNGODON IDELLUS

WANG Hong-Quan1, TANG De-Yue1, ZHAO Yu-Rong1, WANG Xiao-Na1, JIN Bo-Tao1, ZHANG Kai2and XIAO Tiao-Yi1
(1.College of Animal Science and Technology, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2.Datonghu Tianhong Aquatic Products Co., Ltd., Yiyang 413207, China)

To investigate effects ofAchyranthes bidentatapolysaccharide (ABP) on immunity and antioxidant function of grass carps, five test groups were used, which consisted of control group, 0.05%, 0.10 %, 0.20 % and 0.40 % ABP addition group.375 grass carps with similar body weight (88.13±0.76) g were randomly allotted to five groups with three replicates and with 25 grass carps in each replicate and were fed for 65d.The results showed as follows: compared with the control group, 0.20% ABP addition significantly increased the contents of serum tumor necrosis factor-α (TNF-α), the activities of serum superoxide dismutase (SOD), acid phosphatase (ACP) and lysozyme (LZM) (P<0.05), significantly decreased the contents of serum malondialdehyde (P<0.05).0.40% ABP addition significantly increased the contents of serum total protein (TP) and the activities of serum alkaline phosphatase (AKP).0.10% ABP addition significantly increased spleen somatic index of grass carp.However, the number of Nitroblue tetrazolium (NBT) positive cells, the contents of serum albumin (ALB), interleukin 1(IL-1) and interleukin 6 (IL-6) were not significantly affected by ABP supplementation (P>0.05).These results indicate that dietary appropriate ABP can significantly promote immunity and antioxidant function of grass carps.We suggest that the appropriate ABP content was 0.20 % in feed of grass carp.

Grass carp; Achyranthes bidentata polysaccharide; Immunity; Antioxidant function

S965.1

A

1000-3207(2013)02-0351-07

10.7541/2013.26

2012-11-19;

2012-12-28

湖南省自然科學基金(09038); 國家農業(yè)部現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系國家大宗淡水魚類產業(yè)技術體系常德綜合試驗站(CARS-46-42)資助

王紅權(1971—), 男, 湖南湘陰縣人; 博士; 研究方向為水生動物健康養(yǎng)殖。Email: whq1078@yahoo.com.cn

趙玉蓉, 研究方向為水產動物營養(yǎng)與飼料。Email: zyr36@yahoo.com.cn; 肖調義, E-mail: tyx1128@yahoo.com.cn