孟繁杰，曹 斌，馮增利，王海剛，馬順茂，趙文增，尹東劍

無(wú)論是在自然發(fā)生的肝癌中還是在人工鼠肝癌模型中，都頻繁檢測(cè)到了H-ras的突變[1-2]。文獻(xiàn)報(bào)道，在肝癌中H-ras的突變率在29.3%～57.1%[3-4]。抑制突變的H-ras的表達(dá)，可有效抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。因此，對(duì)肝癌的基因治療可以通過(guò)抑制突變的H-ras而實(shí)現(xiàn)。本研究采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)BEL7402肝癌細(xì)胞株H-ras的突變類(lèi)型，進(jìn)而設(shè)計(jì)出特異性的短發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒表達(dá)載體，從而達(dá)到只抑制第12位密碼子GGC突變形式為GTT的H-ras，而不影響野生型H-ras的目的。

1　材料與方法

1.1材料肝癌細(xì)胞株BEL7402(H-ras第12位密碼子GGC突變?yōu)镚TT)和SMMC7721(H-ras第12位密碼子為野生型的GGC)，均購(gòu)自美國(guó)American Type Culture Collection(ATCC)。pSilencerTM4.1-CMV hygro試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambion公司。大腸埃希菌(E.coli) DH5α為本室保存。質(zhì)粒中量抽提純化的試劑盒購(gòu)自Promrga公司。RPM 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Sigama公司。Trizol購(gòu)自Invitrogen公司。cDNA第一鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Fermentas公司。PCR引物及插入序列由上海生工生物工程公司合成。H-ras小鼠單克隆抗體購(gòu)自Lab Vision公司。辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司?？捡R斯亮藍(lán)蛋白分析試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞株H-ras的mRNA表達(dá)檢測(cè)將BEL7402和SMMC7721細(xì)胞用Trizol消化，按Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA備用。紫外分光光度計(jì)定量總RNA，調(diào)整濃度為1 μg/μl。按cDNA第一鏈反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)采用隨機(jī)引物法合成cDNA。H-ras的引物序列：上游5′-GCGCCTGTGAACGGTGG-3′，下游5′-TGGGCACGTCATCCGAGTCC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度397 bp。PCR 參數(shù)：94 ℃ 10 min變性，94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖電泳，電壓100 V，45 min。

1.2.2編碼shRNA的插入片段的合成根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的已知H-ras基因[NM_001130442.1]的序列，選擇一段19個(gè)堿基的核苷酸片段，把第12位密碼子的GGC換成GTT作為靶序列，將其正義和其互補(bǔ)序列分別連接在回路TTCAAGAGA堿基的兩端，在5′端和3′端加上固定的黏性末端，人工合成一對(duì)編碼針對(duì)H-rasVal12的突變特異性shRNA的DNA插入片段。用pSilencerTM4.1-CMV hygro試劑盒提供的shRNA的DNA插入片段作為對(duì)照。經(jīng)Blast同源序列分析軟件證實(shí)與人類(lèi)其他基因無(wú)同源性。

1.2.3質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建、擴(kuò)增和純化將合成的編碼針對(duì)H-rasVal12的突變特異性shRNA的DNA插入片段按說(shuō)明書(shū)與載體pSilencerTM4.1-CMV hygro連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒以常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α后，在含有氨芐西林的LB固體培養(yǎng)皿里培養(yǎng)，12 h后挑取單克隆搖菌，重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序證實(shí)。兩種重組質(zhì)粒的擴(kuò)增及純化參照Promega質(zhì)粒中量抽提純化試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4細(xì)胞的H-ras突變鑒定、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用張峰等[6]所述方法鑒定H-ras的序列。SMMC7721和BEL7402 細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPM 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代。轉(zhuǎn)染前1 d，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于6孔板，于24 h內(nèi)細(xì)胞融合達(dá)40%～60%時(shí)按Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4 h后，用含胎牛血清的RPM 1640培養(yǎng)基取代轉(zhuǎn)染混合液，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)質(zhì)粒表達(dá)載體對(duì)H-ras蛋白表達(dá)的影響按Trizol說(shuō)明書(shū)提取總胞質(zhì)蛋白，按孟繁杰等[7]所述方法進(jìn)行Western blot操作。結(jié)果用Gel 1D凝膠圖像分析系統(tǒng)分析測(cè)定其光密度。計(jì)算各個(gè)樣本H-ras蛋白的積分光密度。

1.2.6流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體48 h后，按孟繁杰等[8]所述方法處理細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞株H-ras的mRNA表達(dá)檢測(cè)SMMC7721和BEL7402細(xì)胞株均檢測(cè)到H-ras的表達(dá)(見(jiàn)圖1)。

圖1　SMMC7721和BEL7402 細(xì)胞株均檢測(cè)到H-ras的表達(dá)Figure 1　The H-ras gene expression detected in cell lines SMMC7721 and BEL7402

2.2細(xì)胞的H-ras突變經(jīng)測(cè)序證實(shí)，SMMC7721的H-ras基因?yàn)橐吧?，其?2位密碼子為GGC，編碼甘氨酸(Gly)；BEL7402的H-ras基因第12位密碼子由GGC突變?yōu)镚TT，編碼纈氨酸(Val)(見(jiàn)圖2)。

圖2　BEL7402的H-ras基因第12位密碼子由GGC突變?yōu)镚TTFigure 2　The GGC mutate into GTT of 12th codon of H-ras gene in cell lines BEL7402

2.3質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建兩種質(zhì)粒表達(dá)載體的序列見(jiàn)圖3。

圖3　H-rasVal12的2個(gè)特異性質(zhì)粒表達(dá)載體序列Figure 3　Two sequence of the specific plasmid expression vector of the gene H-rasVal12

2.4質(zhì)粒表達(dá)載體對(duì)H-ras蛋白表達(dá)的影響圖4為Western blot檢測(cè)結(jié)果，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染前、后SMMC7721的H-ras蛋白表達(dá)量(以光密度值表示)分別為(1 752±21)和(1 736±28)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.474，P=0.646)。轉(zhuǎn)染了H1-shRNA的BEL7402的H-ras蛋白表達(dá)量轉(zhuǎn)染前、后分別為(1 221±11)和(920±11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.126，P<0.01)。轉(zhuǎn)染了H2-shRNA的BEL7402的H-ras蛋白表達(dá)量轉(zhuǎn)染前、后分別為(1 201±10)和(872±10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.477，P<0.01)。H1-shRNA和H2-shRNA組H-ras蛋白表達(dá)下調(diào)了62.8%和63.4%。

圖4　Western blot檢測(cè)H-ras蛋白的表達(dá)Figure 4　The expression of H-ras protein detected by Western blot

圖5　轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)載體前后BEL7402的流式細(xì)胞儀結(jié)果Figure 5　The FCM of cell lines BEL7402 before and after tansfected by different plasmid expression vector

3　討論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，占我國(guó)惡性腫瘤死亡率的第二位，手術(shù)切除后5年復(fù)發(fā)率達(dá)54.1%～61.5%。目前，雖然肝癌的治療已取得了很大進(jìn)展，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是進(jìn)一步改善預(yù)后的障礙。如何控制肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，已成為提高肝癌患者預(yù)后的瓶頸?，F(xiàn)有的治療手段效果一般，臨床上迫切需要針對(duì)肝癌的新的更有效的治療方法。隨著近年人們對(duì)肝癌相關(guān)基因的進(jìn)一步了解和基因治療的迅速發(fā)展，同其他惡性腫瘤一樣，探索肝癌的基因治療已具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。研究表明，肝癌細(xì)胞中存在H-ras基因的突變和高表達(dá)，并且與肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。Liao等[5]學(xué)者通過(guò)反義核酸技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞株突變的H-ras基因后，觀察到肝癌細(xì)胞株的增殖力下降，凋亡率上升，并抑制裸鼠實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。其他學(xué)者的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，抑制了肝癌細(xì)胞株突變的H-ras基因后肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移力下降，為肝癌的基因治療提供了一個(gè)切入點(diǎn)。但由于各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)(如反義核酸技術(shù)和核酶技術(shù))難以同時(shí)滿(mǎn)足特異抑制目的基因和避免轉(zhuǎn)基因引起的干擾素反應(yīng)問(wèn)題，臨床試驗(yàn)均告失敗。

隨著RNAi技術(shù)的產(chǎn)生，越來(lái)越多的研究表明用RNAi技術(shù)可有效地、特異地抑制目的基因的表達(dá)。即使目的基因只有一個(gè)堿基的不同，它也能將其有效特異抑制，而且?guī)缀醪灰鸶蓴_素反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)有效地解決了上述難題。繼Brummelkamp等[9]最先用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)抑制了第12位密碼子突變形式為GTT的胰腺癌K-ras基因，未發(fā)現(xiàn)對(duì)野生型K-ras的影響后，眾多學(xué)者開(kāi)始嘗試用這一技術(shù)來(lái)達(dá)到特異抑制目的基因的目的。用RNAi技術(shù)來(lái)抑制其他與肝癌有關(guān)的基因的研究與日俱增，但至今尚未有人用該技術(shù)來(lái)抑制肝癌細(xì)胞中的H-ras基因。Yang等[10]已經(jīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的shRNA成功抑制了人卵巢癌細(xì)胞珠中的H-ras基因，提示用RNAi技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞中H-ras基因的可行性。

RNAi是指短的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)可以降解內(nèi)源的同源RNA而使相應(yīng)基因沉默的現(xiàn)象。該現(xiàn)象在1998年由Fire等[11]首次報(bào)道，研究者發(fā)現(xiàn)只要有少量dsRNA分子存在，就足以幾乎完全消除與dsRNA同源的基因的表達(dá)，導(dǎo)致基因沉默。這是生物進(jìn)化過(guò)程中細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制，可避免外源性基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，同時(shí)對(duì)于細(xì)胞內(nèi)宿主基因的表達(dá)和細(xì)胞發(fā)育發(fā)揮重要作用。RNA干擾起始于RNA酶Ⅲ家族成員DICER識(shí)別雙鏈RNA并將其切割成21～23個(gè)核苷酸片斷。然后，RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-inducing silencing complex，RISC)以這些片斷的一條鏈為模板切割互補(bǔ)的mRNA。目前，載體策略已逐漸成為進(jìn)行RNAi研究的首選。

本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的已知H-ras基因[NM_001130442.1]的序列， 選擇了兩段19個(gè)堿基的核苷酸片段，把第12位密碼子的GGC換成GTT作為靶序列，人工合成兩對(duì)編碼針對(duì)H-rasVal12的突變特異性shRNA的DNA插入片段。然后將其插入Ambion公司的pSilencerTM4.1-CMV hygro載體，得到針對(duì)H-rasVal12的突變特異性shRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的SMMC7721和BEL7402細(xì)胞。Western blot檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染后有效地抑制了H-ras蛋白的表達(dá)，而對(duì)野生型的H-ras蛋白表達(dá)無(wú)影響。細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，其可增加BEL7402細(xì)胞的凋亡率。針對(duì)H-rasVal12的編碼突變特異性shRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究H-ras基因在肝癌中的具體作用機(jī)制和肝癌的基因治療奠定了基礎(chǔ)。

1Reynolds SH，Stowers SJ，Patterson RM，et al.Activated oncogenes in B6C3F1 mouse liver tumors：implications for risk assessment[J].Science，1987，237(4820)：1309-1316.

2Wiseman RW，Stowers SJ，Miller EC，et al.Activating mutations of the c-Ha-ras protooncogene in chemically induced hepatomas of the male B6C3 F1 mouse[J].Proc Natl Acad Sci USA，1986，83(16)：5825-5829.

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4Iida M，Iwata H，Inoue H，et al.Correlation between Bcl-2 overexpression and H-ras mutation in naturally occurring hepatocellular proliferative lesions of the B6C3F1 mouse[J].Toxicol Sci，2000，56(2)：297-302.

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6張峰，劉三光，劉曄，等.突變體富集聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)胰腺癌K-ras基因突變的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2005，22(8)：1018.

7孟繁杰，付澤嫻，張峰，等.應(yīng)用載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)抑制胰腺癌細(xì)胞K-RASAsn12的表達(dá)[J].中國(guó)生物工程雜志，2006，26(4)：86-90.

8孟繁杰，曹斌，蔡建輝.針對(duì)K-rasAsn2的短發(fā)夾RNA表達(dá)載體對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2008，25(3)：396.

9Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R，et al.Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference[J].Cancer Cell，2002，2(3)：243-247.

10Yang G，Thompson JA，F(xiàn)ang B，et al.Silencing of H-ras gene expression by retrovirus-mediated siRNA decreases transformation efficiency and tumorgrowth in a model of human ovarian cancer[J].Oncogene，2003，22(36)：5694-5701.

11Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391(6669)：806-811.