曹天澤，高維實(shí)，郭慧軍，馬虎林，施曉輝

樹突細(xì)胞(DC)是體內(nèi)最高效能的抗原提呈細(xì)胞,在抗腫瘤免疫中處于核心地位[1]。Kjaergaard 等[2]進(jìn)行的動(dòng)物模型研究顯示,將DC與各種腫瘤抗原相結(jié)合構(gòu)建DC腫瘤疫苗,可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。有研究將進(jìn)展期腎癌患者自體腎癌細(xì)胞裂解，將獲得的腫瘤抗原制備DC疫苗，使患者免疫狀態(tài)顯著改善[3-4]。張莉等[5]利用細(xì)胞因子大量擴(kuò)增從宮頸癌患者外周血中獲得的DC，其表面高表達(dá)CD86、CD1a、CD83、HLA-DR等表面分子，此DC能將腫瘤抗原有效提呈給T淋巴細(xì)胞，從而在體內(nèi)外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。隨著DC培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，DC疫苗已經(jīng)開始進(jìn)入臨床。應(yīng)用何種方式抗原修飾DC產(chǎn)生良好的抑瘤作用是目前研究的一大熱點(diǎn)。本研究分別采用純化培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞、乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3所制備的凍融抗原分別負(fù)載自體外周血來(lái)源的DC，比較3種疫苗的抗原活性，為DC疫苗的臨床制備及其應(yīng)用提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 純化培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞(A組)、乳腺癌組織(B組)取自我院腫瘤外科乳腺癌手術(shù)患者，均經(jīng)病理核實(shí)。乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3(C組)購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)。

1.2 主要試劑 重組人粒細(xì)胞-巨細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白介素4(rhIL-4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(PEPRO TECH公司)，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記小鼠抗人CD80和CD83熒光單克隆抗體、異硫氰酸(FITC)標(biāo)記小鼠抗人CD86和HLA-DR熒光單克隆抗體(BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 純化培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞 無(wú)菌條件下獲取新鮮腫瘤組織，將“癌巢”部分銳性粉碎，并將獲得的腫瘤組織分成等質(zhì)量的兩份(以電子天平稱取精確到0.001 g)，一份置于液氮罐中保存?zhèn)溆?。另一份以預(yù)熱的膠原酶V進(jìn)行消化，經(jīng)洗滌、計(jì)數(shù)后接種，以選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，貼壁后去上清及雜細(xì)胞，獲得患者自體純化的乳腺癌細(xì)胞(見圖1)，以病理細(xì)胞學(xué)檢測(cè)證實(shí)。

1.3.2 制備乳腺癌凍融抗原 培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3。收集1×105的純化培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞及SKBR-3，洗滌后制備凍融抗原，采用Lowry法測(cè)定蛋白含量，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，蛋白濃度調(diào)至2 mg/ml,用微孔濾膜(0.22 μm)過濾，-86 ℃保存?zhèn)溆?。將液氮保存的乳腺癌組織以研缽研磨、超聲粉碎儀粉碎后，同上法制備抗原。

1.3.3 誘導(dǎo)DC 按本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的方法[6]分離外周血的PBMCs，貼壁后去懸浮細(xì)胞，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。隔天半換液，維持rhGM-CSF、rhIL-4的終濃度不變，并于第6天在加入TNF-α 30 ng/ml的同時(shí)分別加入3組凍融抗原。第7天收獲負(fù)載了乳腺癌抗原的成熟DC疫苗(見圖2)。

圖1 純化培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞

圖2 負(fù)載抗原的成熟DC疫苗

1.3.4 流式細(xì)胞儀分析 用直接熒光標(biāo)記法標(biāo)記后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。調(diào)整DC疫苗的懸液細(xì)胞密度至5×105/ml,各取50 μl細(xì)胞懸液，分別加入20 μl與其相應(yīng)的抗體工作液，搖勻、避光，室溫下孵育20 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，立即上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣本數(shù)>5×104。獲取樣本中1×104陽(yáng)性表達(dá)率。用同型IgG相應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5 DC疫苗刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) 用尼龍毛法獲取外周血T淋巴細(xì)胞,調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞及3組DC疫苗濃度均為5×104/ml，將3組疫苗分別加入96孔板,按照1∶1比例加入T淋巴細(xì)胞，每種比例設(shè)6個(gè)復(fù)孔,靜置培養(yǎng)3 d。混合培養(yǎng)結(jié)束前12 h加入3H-TdR,每孔實(shí)際放射比活度為1 μCi，用Beckman液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)量CPM值,以空白T細(xì)胞孔及空白DMEM培養(yǎng)基孔分別作為對(duì)照檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 3組的CD80、CD83、CD86和HLA-DR比較 誘導(dǎo)7 d后，3組DC的CD80、CD83、CD86和HLA-DR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中A、C組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組與C組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

表1 3組CD80、CD83、CD86和HLA-DR比較

注：與B組比較，*P<0.05

2.2 3組CPM值比較 A組CPM值為(13 047±215)，B組為(4 964±148)，C組為(5 082±176)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5 200.7159，P=0.0000)；其中A組與B、C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為125.8166和123.9803，P<0.01)；B組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.8363，P>0.05)。

3 討論

DC作為最有效、功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞,在腫瘤免疫研究中具有獨(dú)特的地位。近年來(lái)隨著對(duì)DC生物學(xué)特性研究的進(jìn)展，以DC為佐劑的免疫療法已應(yīng)用在一些惡性腫瘤治療的臨床研究中，取得了令人滿意的療效[7-8]。在體內(nèi)，DC可直接進(jìn)入腫瘤區(qū)域獲得腫瘤抗原，并向T淋巴細(xì)胞呈遞抗原，從而誘發(fā)CTL反應(yīng)。DC作為抗原專職遞呈細(xì)胞，其成熟度與其生物學(xué)功能密切相關(guān)，未成熟的DC具有很強(qiáng)的捕獲、加工處理抗原的能力。而成熟的DC則高表達(dá)共刺激分子，具有很強(qiáng)的將腫瘤抗原遞呈給T細(xì)胞的能力。腫瘤患者由于缺乏專職抗原遞呈細(xì)胞的有效遞呈，導(dǎo)致初始型T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用耐受或無(wú)能，阻礙T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫有效激活[9]。從目前的研究來(lái)看，DC疫苗的抗癌作用是肯定和安全的，但所知的腫瘤特異性抗原很少且無(wú)法應(yīng)用在臨床治療中，而凍融抗原修飾DC具有顯著的治療效果[10]。岳玲玲等[11]也證實(shí)在凍融抗原負(fù)載DC陽(yáng)性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用低效靶比獲得較好的殺傷效能。因此本研究選用反復(fù)凍融法制備全腫瘤細(xì)胞抗原致敏DC。腫瘤凍融抗原包括了胞膜和胞內(nèi)抗原，其特異性低但個(gè)體化特點(diǎn)明顯，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多克隆的CD8+CTL和 CD4+CTL，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了全抗原融合疫苗體外實(shí)驗(yàn)可顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)[12]。

本研究旨在比較不同的凍融抗原所致敏的DC疫苗的抗原活性有無(wú)差異。結(jié)果顯示，3種不同凍融抗原致敏的DC疫苗在流式細(xì)胞表型檢測(cè)及T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中有顯著差異。細(xì)胞株抗原組與純化的腫瘤細(xì)胞抗原組均具有較高的細(xì)胞表型，但在自體的T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，純化培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞組表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗原活性，在負(fù)載DC后，其所介導(dǎo)的抗腫瘤免疫要優(yōu)于乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3組，其原因尚未清楚，是否在自體抗原中包括了更多的個(gè)體化的、尚未被發(fā)現(xiàn)的抗原分子或者是在DC分子表面具有更加嚴(yán)格的個(gè)體化的抗原受體表位，還有待于進(jìn)一步研究。

目前，以各種基因、蛋白提取物及某些抗原肽作為佐劑的報(bào)道很多，也均在體外實(shí)驗(yàn)中取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，以某一種基因或抗原肽負(fù)載DC的腫瘤免疫治療并沒有取得預(yù)想的臨床效果，究其原因可能與已知的腫瘤抗原很少、有些腫瘤缺乏特異性抗原、負(fù)瘤的機(jī)體由于腫瘤內(nèi)環(huán)境所導(dǎo)致的免疫耐受以及機(jī)體的免疫呈遞功能低下有關(guān)。

Rosenblatt等[13]認(rèn)為將DC和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合是刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤的CTL反應(yīng)的有效疫苗，并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有力的溶瘤作用，就是使腫瘤細(xì)胞的全部抗原提呈給DC，繼而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤反應(yīng)。這種方法避免了使用單一抗原或基因等佐劑作為靶抗原的缺點(diǎn)，而是為T淋巴細(xì)胞提呈了腫瘤的全套抗原，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

綜上所述，將細(xì)胞的全部抗原提呈給DC可以很好地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤反應(yīng)，但是如何更完整地保留腫瘤的全部抗原又以怎樣的方式與DC結(jié)合，還有待于進(jìn)一步研究。

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