田小芍 ,陳明 ,劉春霞

吡唑化合物 pyr3 干預(yù)對壓力負荷誘導(dǎo)的大鼠左心室肥厚的影響

田小芍 ,陳明 ,劉春霞

目 的：探 討 瞬 時 受 體 電 位 通 道 C 亞 族 3 亞 型（TRPC3） 的 選 擇 性 阻 滯 劑 吡 唑 化 合 物 Ethyl-1-(4-(2,3,3-trichloroacrylamide)phenyl)-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrazole-4-carboxylate（pyr3）的體內(nèi)干預(yù)對壓力負荷大鼠左心室肥厚（LVH）程度的影響。

Ethyl-1-(4-(2,3,3-trichloroacrylamide)phenyl)-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrazole-4-carboxylate ；壓力負荷；左心室肥厚；瞬時受體電位通道C亞族3亞型；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:226.)

阻止和逆轉(zhuǎn)左心室肥厚 (LVH)一直是心血管病研究的熱點和難點。從 LVH形成機制的研究中尋找有效藥理學靶點可能是阻止和逆轉(zhuǎn) LVH 的重要及可能有效途徑。瞬時受體電位通道C亞族3亞型（TRPC3）是細胞膜上非電壓依賴的 Ca2+通道。研究顯示， TRPC3 在 LVH 形成過程中起重要作用。TRPC3 基因顯性失活或體外細胞培養(yǎng)運用 TRPC3 通道阻滯劑均證實能夠有效減弱神經(jīng)內(nèi)分泌和壓力負荷誘導(dǎo)的LVH[1,2]，但目前相關(guān) TRPC3 阻滯劑的體內(nèi)研究甚少。為此，本研究運用 TRPC3 的選擇性阻滯劑 pyr3，探討其體內(nèi)干預(yù)對壓力負荷大鼠LVH程度的影響。

1 材料與方法

材 料： 實 驗 的起止 時 間 為 2011-11 至 2012-09。實驗動物：8 周齡雄性 SD 大鼠 40 只（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心）。主要試劑、儀器：pyr3（美國Sigma 公司 ）；核糖核酸（RNA）提取試劑盒 Trizol、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、脫氧核糖核酸（DNA）標記（寶生物工程大連有限公司）；山羊抗 TRPC3 抗體（英國 Abcam 公司）；兔抗鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 抗體（美國 Epitomic 公司 ）；凝膠成像系統(tǒng)和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀（美國 BIO-RAD 公司）。

方法：建立模型及實驗分組 40 只 8 周齡 SD 大鼠，編號并隨機抽出 27 只行腹主動脈縮窄術(shù)[3]，術(shù)后第 6天，存活的 18 只重新編號并隨機分為 3 組（n=6）：手術(shù)對照組：僅行腹主動脈縮窄術(shù)；手術(shù)后全程給藥組：術(shù)后第6天至第6周末給藥的；手術(shù)后后期給藥組：手術(shù)后第5周始到第6周末給藥的。另13只行假手術(shù)[3]，手術(shù)后第 6 天，存活的 12 只編號并隨機分為兩組（n=6）：假手術(shù)對照組(只行腹主動脈剝離，但不做縮窄手術(shù) )；假手術(shù)后全程給藥組：假手術(shù)后第 6 天至第6周末給藥的。術(shù)后第6天，5組30只大鼠中的各給藥組按要求開始每天腹腔注射 pyr3（ 0.1 mg/kg）[4]，對照組給予用雙蒸水稀釋至 2%的二甲亞砜（1 ml/kg）。

左心室質(zhì)量指數(shù)的檢測：5 組共 30 只大鼠術(shù)后6周末稱重后處死，迅速取出心臟，低溫下剪取左心室和室間隔并稱重，計算左心室質(zhì)量指數(shù)。

左心室心肌細胞橫徑的測量：采用 HE 染色，高倍鏡采集圖片，用 IPP 6.0 軟件在每張圖片中隨機選取20個胞漿清晰、胞核完整的心肌細胞，經(jīng)核處測量其橫徑，取均值。

左心 室 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ mRNA表達的測定：Trizol提取總核糖核酸（RNA），反轉(zhuǎn)錄生成互補脫氧核糖核酸（cDNA）。擴增引物序列： TRPC3（461bp）F:5'-ttcatggttctcttcatcatgg-3'，R: 5'-aagtcttctcctcctgcatttg-3'； 鈣 調(diào) 神 經(jīng) 磷 酸 酶Aβ（265bp）F:5'-ttctcagggaggagagtgaaag-3'，R:5'-gtgttcagggaattgaaaccat-3'；磷酸甘油醛脫氫酶 (GAPDH) F:5'acagcaacagggtggtggac-3'，R:5'tttgagggtgcagcgaactt-3'；β- 肌 動 蛋 白 (β-actin)F:5'-ccacgaaactaccttcaactcc-3'，R:5'-gtgatctccttctgcatcctgt-3'。 擴 增 TRPC3 基 因 的 PCR條件：94℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性 30 s，61℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共擴增 35 個循環(huán)，于 72 ℃再延伸5 min。擴增鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ、GAPDH 及 β-actin基因的退火溫度為 58 ℃、60 ℃和 60 ℃，均擴增 30個循環(huán)，余同 TRPC3 基因的擴增。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳。Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進行光密度分析，測定以上指標信使核糖核酸（mRNA）相對含量。

左心室 TRPC3 蛋白免疫組織化學染色：按文獻方法[5]對各組左心室心肌組織進行包埋、切片及TRPC3 蛋白免疫組織化學染色。用 IPP6.0 圖像分析軟件分析結(jié)果。

左心室 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白免疫印跡：提取左心室心肌細胞膜蛋白并定量，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（TRPC3、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 為 1:2000，β-actin 為 1:1000）和二抗。顯色后用 Quantity One 采集圖像，β-actin 為內(nèi)參分析光密度，測定各樣本目的蛋白相對含量。

統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS Statistics V17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，各組兩兩比較用 Bon ferron i法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑的比較 ：圖1、2 為各組大鼠心肌組織橫切面 HE 染色。手術(shù)對照組左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑顯著高于假手術(shù)對照組；手術(shù)后全程給藥組和手術(shù)后后期給藥組上述兩個指標較手術(shù)對照組均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜ 0.05）。假手術(shù)后全程給藥組與假手術(shù)對照組間兩個指標差異無統(tǒng)計學意義。表1

表1 各組左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑的比較

表1 各組左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑的比較

注：與假手術(shù)對照組比*P ＜ 0.05 與手術(shù)對照組比?P ＜ 0.05

組別 左心室質(zhì)量指數(shù)（m g / g）左心室心肌細胞橫徑( μ m )假手術(shù)對照組 1 . 9 1 ± 0 . 5 9 1 4 . 0 3 ± 0 . 1 7手術(shù)對照組 3 . 1 0 ± 0 . 2 7* 2 0 . 4 1 ± 0 . 7 9*假手術(shù)后全程給藥組 1 . 9 2 ± 0 . 0 5 1 4 . 1 5 ± 0 . 2 7手術(shù)后后期給藥組 2 . 8 3 ± 0 . 2 3? 1 8 . 6 3 ± 0 . 6 0?手術(shù)后全程給藥組 2 . 4 6 ± 0 . 1 1? 1 5 . 9 5 ± 0 . 3 9?

圖1 各組大 鼠心臟橫切面 HE 染色 圖2 各組大鼠左心室心肌組織橫切面 HE 染色 圖3 各組大鼠左心室心肌組織 TRPC3 免疫組織化學染色 A：假手術(shù)對照組 B：手術(shù)對照組 C：假手術(shù)后全程給藥組 D：手術(shù)后后期給藥組 E：手術(shù)后全程給藥組。TRPC3：瞬時受體電位通道 C 亞族 3 亞型 箭頭所指為陽性顆粒

TRPC3 的免疫組織化學染色結(jié)果：如圖3 所示，棕黃色顆粒為 TRPC3 陽性表達。IPP6.0 軟件分析光密度示，手術(shù)對照組和假手術(shù)后全程給藥組 TRPC3表達顯著高于假手術(shù)對照組；手術(shù)后全程給藥組TRPC3 表達較手術(shù)對照組顯著減少，上述差異均有統(tǒng)計學意義（P 均 ＜ 0.05）。

TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 AβmRNA 的表達：如圖4、5示，手術(shù)對照組和假手術(shù)后全程給藥組TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ的 mRNA 表達均顯著高于假手術(shù)對照組；手術(shù)后全程給藥組上述兩個指標均顯著低于手術(shù)對照組；手術(shù)后后期給藥組鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 AβmRNA 的表達較手術(shù)對照組降低，上述比較的差異均有統(tǒng)計學意義（P 均 ＜ 0.05），而手術(shù)后后期給藥組 TRPC3 的 mRNA 表達較手術(shù)對照組未見顯著減少（P＞0.05）。

TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 的免疫印跡結(jié)果： 如圖6、7 所示，手術(shù)對照組和假手術(shù)后全程給藥組左心室 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白表達量顯著高于假手術(shù)對照組；手術(shù)后后期給藥組和手術(shù)后全程給藥組與手術(shù)對照組相比，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 表達均有顯著下降，而 TRPC3 的蛋白表達只有手術(shù)后全程給藥組顯著降低，上述比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜ 0.05）。

圖4 TRPC3 和 CaN Aβ 基因 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析 圖5 各組 TRPC3 和 CaN Aβ mRNA 表達的相對含量結(jié)果的比較 與假手術(shù)對照組比較*P＜0.05 與手術(shù)對照組比較?P＜0.05 TRPC3：瞬時受體電位通道 C亞族 3 亞型 GAPDH：磷酸 甘油醛脫氫酶 CaN Aβ：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ mRNA：信使核糖核酸 M：分子量 Marker 余注見圖1

圖6 各組 TRPC3 和 CaN Aβ 蛋白表達的蛋白免疫印跡結(jié)果 圖7 各組 TRPC3 和 CaN Aβ 蛋白表達相對含量結(jié)果的比較 與假手術(shù)對照組比較*P ＜ 0.05 與手術(shù)對照組比較?P ＜ 0.05。 余注見圖1

3 討論

pyr3 能有效阻斷 TRPC3 相關(guān)的鈣庫操縱性鈣離子內(nèi)流[6]，減少肥厚因子心房鈉尿肽、腦鈉肽基因表達[7，8]。日本學者首次指出在體應(yīng)用 pyr3（0.1mg/kg per day）可以減弱小鼠壓力負荷誘導(dǎo)的心肌肥厚[4]。但目前，相關(guān)動物體內(nèi)試驗研究報道甚少，結(jié)果有待明確。

本研究運用腹主動脈縮窄建立大鼠壓力負荷模型，模擬 TRPC 通道激活條件。腹主動脈縮窄手術(shù)急性期后即給予 pyr3 直到術(shù)后 6 周末，不僅顯著減弱了大鼠壓力負荷刺激下左心室肥厚的程度，同時也使鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 和 TRPC3 蛋白和 mRNA的表達明顯下調(diào)。據(jù)我們所知，這是較早在SD大鼠體內(nèi)給予 TRPC 通道阻滯劑的實驗研究，這一結(jié)果有重要的理論意義和潛在的臨床價值。

術(shù)后第5周開始給藥至第6周末的大鼠，雖然左心室肥厚程度及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白和mRNA 表達也有一定程度的下降，但是 TRPC3 的蛋白和mRNA表達無明顯變化。這可能是由于一種涉及 TRPC 通道和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 /活化的 T 細胞核因子信號通路的激活之間的正反饋調(diào)節(jié)機制。Bush 等[9]提出 TRPC 通過一種正反饋調(diào)節(jié)機制促使了心臟肥大增生。病理的壓力刺激導(dǎo)致了磷脂酶C的激活和胞內(nèi) Ca2+庫的排空，這可能使 TRPC 通道激活并產(chǎn)生一個足以激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化的T細胞核因子信號通路的 Ca2+信號。TRPC3 自身基因表達也受鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化的T細胞核因子信號通路的調(diào)控，他們形成一種正反饋調(diào)節(jié)使心臟中肥大基因的表達處于一個穩(wěn)定的狀態(tài)。也有學者指出 TRPC3 參與調(diào)節(jié)心肌細胞中的鈣庫操縱性鈣離子內(nèi)流，阻止其活性能夠減弱神經(jīng)激素刺激導(dǎo)致的心房鈉尿肽的表達和心肌細胞體積的增大，而肥厚心肌細胞中 TRPC3的過表達在心肌肥大的過程中能通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 /活化的 T 細胞核因子信號通路得以放大[10]。而腹主動脈縮窄術(shù)后第5周才開始給藥可能是由于此時心肌肥厚已經(jīng)形成，壓力負荷下 TRPC3 的表達已經(jīng)明顯上調(diào)，因此藥物干預(yù)對肥厚的阻止和逆轉(zhuǎn)效果不明顯，TRPC3 基因和蛋白表達較手術(shù)不給藥也無明顯降低，這也可能和給予 pyr3 時間過短有關(guān)，推測如果更長時間地給予 pyr3，已經(jīng)肥厚的心肌可能逆轉(zhuǎn)，有待進一步研究。

作為對照，大鼠假手術(shù)急性期后同樣用 pyr3 進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn) pyr3 對假手術(shù)大鼠左心室心肌細胞大小無影響，而使鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 和 TRPC3 的蛋白和 mRNA 表達上調(diào)。這可能是由于生理性的TRPC3 活性被阻滯后，心肌細胞內(nèi) Ca2+減少，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性減弱，從而通過負反饋作用上調(diào)TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶基因和蛋白的表達來實現(xiàn)正常生理需要下 TRPC3 對 Ca2+及調(diào)神經(jīng)磷酸酶對肥厚相關(guān)通路的調(diào)控。有關(guān)TRPC3和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 /活化的 T細胞核因子信號通路間正負反饋機制非常復(fù)雜，仍待深入研究和明確。但是本研究初步證實 TRPC3 選擇性阻滯劑 pyr3 較長時間體內(nèi)干預(yù)對高血壓左心室肥厚的阻止和初步逆轉(zhuǎn)作用，提示pyr3 或其同類藥物可能成為日后心血管臨床逆轉(zhuǎn)壓力負荷導(dǎo)致的 LVH的新藥，值得深入研究。

[1]Wu X, Eder P, Chang B, et al. TRPC channels are necessary mediators of pathologic cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107:7000-7005.

[2]Nakayama H, Wilkin BJ, Bodi I, et al. Calcineurin-dependent cardiomyopathy is activated by TRPC in the adult mouse heart. FASEB J, 2006, 20:1660-1670.

[3]張淑華，王云霞，張娜，等 .纈沙坦、氨氯地平及螺內(nèi)酯聯(lián)合應(yīng)用對大鼠腹主動脈部分縮窄引起心肌肥厚的影響 .中國循環(huán)雜志，2012，27：383-386.

[4]Kiyonaka S, Kato K, Nishida M, et al. Selective and direct inhibition of TRPC3 channels underlies biological activities of a pyrazole compound. Proc Natl Acad Sci, 2009, 106: 5400-5405.

[5]廖雪艷， 陳 明， 余冬梅 .不 同 降 壓 藥 物 干 預(yù)對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈瞬時受體電位通道 C亞族表達的影響.中國循環(huán)雜志，2011，26：65-68.

[6]Kiyonaka S, Kato K, Nishida M. et al. Pharmacological properties of novel TRPC channel inhibitors. Yakugaku Zasshi, 2010, 130:303-311.

[7]Klaiber M, Dankworth B, Kruse M, et al. A cardiac pathway of cyclic GMP-independent signaling of guanylyl cyclase A, the receptor for atrial natriuretic peptide. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108:18500-18505.

[8]Schleifer H, Doleschal B, Lichtenegger M, et al. Novel pyrazole compounds for pharmacological discrimination between receptoroperated and store-operated Ca2+ entry pathways. Br J Pharmacol, 2012, 10: 1476-5381.

[9]Bush EW, Hood DB, Papst PJ, et al. Canonical transient receptor potential channels promote cardiomyocyte hypertrophy through activation of calcineurin signaling. J Biol Chem, 2006, 281: 33487-33496.

[10]Guinamard R, Bois P. Involvement of transient receptor potential proteins in cardiac hypertrophy.Biochim Biophys Acta, 2007,1772:885-894.

Effect of Pyrazol Chemical Compound pyr3 on Pressure Overloaded Rats for Their Left Ventricular Hypertrophy

Tian Xiao-shao, CHEN Ming, LIU Chun-xia.

Department of Cardiology, Chongqing Medical University First Affiliated Hospital, Chongqing (400016), China Corresponding Author: CHEN Ming, Email: chenmingcq@126.com

Objective: To study the effect of a pyrazol chemical compound, pyr3, the selective blocker of transient receptor potential canonical 3 (TRPC3) on pressure overloaded rats for their left ventricular hypertrophy (LVH）in vivo.Methods: The pressure overloaded rats model was established by abdominal aortic constriction. 30 male SD rats With weight of 200～240g were randomly divided into 5 groups: ① Sham operation group, ② Operation control group, ③ Sham operation with whole-course medication group, ④ Operation with later medication group and ⑤ Operation with wholecourse medication group. n=6 in each group and all rats were treated for 6 weeks. The left ventricular mass index (LVMI) and left ventricular myocardial transaction diameter (LVMTD) were calculated; the mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ were examined by RT-PCR, Western blot analysis and immunohistochemistry respectively.Results: Compared with Sham operation group, Operation control group presented the increased LVMI, LVMTD, higher mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ. In Sham operation with whole-course medication group, the left ventricular hypertrophy related indexes were no real changes while the mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ were obviously increased, all P＜0.05. Compared with Operation control group, Operation with whole-course medication groupshowed decreased hypertrophy related indexes and decreased mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ,all P＜0.05. In Operation with later medication group, the hypertrophy related indexes and mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ were decreased, all P＜0.05, while TRPC3 mRNA and protein expression was similar.Conclusion: pyr3 treatment may prevent pressure overloaded rats for their LVH at certain point, and decrease the upregulation of TRPC3 and calcineurin Aβ .

pyr3; Pressure overloaded; Left ventricular hypertrophy; Transient receptor potential canonical 3; Calcineurin Aβ

2012-12-18）

（助理編輯：曹洪紅）

400016 重慶市，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科

田小芍 碩士研究生 主要從事高血壓的發(fā)病機制研究及防治 Email：lmtpershao@163.com 通訊作者：陳明 Email：chenmingcq@126.com

R541

A

1000-3614（2013）03-0226-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.019

方法：采用腹主動脈縮窄手術(shù)建立左心壓力負荷模型。30 只 200～240g 雄性 SD 大鼠隨機分為五組 (n=6)：假手術(shù)對照組、手術(shù)對照組、假手術(shù)后全程給藥組、手術(shù)后后期給藥組，手術(shù)后全程給藥組。6周后，計算各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)、左心室心肌細胞橫徑，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶連反應(yīng)（RT-PCR）、免疫組織化學和蛋白免疫印跡檢測 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 信使核糖核酸（mRNA）和蛋白的表達水平。

結(jié)果：與假手術(shù)對照組相比，手術(shù)對照組左心室肥厚相關(guān)指標 (左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑 )及TRPC3、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ蛋白和mRNA的表達顯著升高；假手術(shù)后全程給藥組左心室肥厚相關(guān)指標無顯著變化，而 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白及 mRNA 的表達量顯著升高 ,差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜ 0.05）。與手術(shù)對照組比較，手術(shù)后全程給藥組左心室肥厚相關(guān)指標、TRPC3及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白和 mRNA 表達均明顯降低（P 均＜ 0.05）；手術(shù)后后期給藥組左心室肥厚相關(guān)指標及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白和 mRNA 的表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜ 0.05），而 TRPC3 的蛋白和 mRNA 表達未見顯著降低。

結(jié)論：pyr3 體內(nèi)干預(yù)能夠一定程度上阻止壓力負荷導(dǎo)致的大鼠左心室肥厚，降低壓力負荷大鼠左心室 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ表達的上調(diào)。