孔靜萍 顧棟樺

RNAi沉默F(xiàn)ascin基因表達(dá)對HEp2細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響

孔靜萍 顧棟樺

目的 通過RNA干擾HEp2細(xì)胞，研究Fascin基因表達(dá)對鱗癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法把特異針對HEp2基因的雙鏈小RNA干擾片段導(dǎo)入HEp2細(xì)胞中，F(xiàn)ascin mRNA及蛋白水平分別用RT-PCR和免疫印跡法檢測，細(xì)胞增殖活性采用MTT法檢測，細(xì)胞周期和凋亡水平采用流式細(xì)胞儀檢測，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力采用Matrigel體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。結(jié)果RNA干擾能顯著抑制Fascin mRNA及蛋白表達(dá)水平；RNA干擾Fascin基因的表達(dá)能使HEp2細(xì)胞增殖活性明顯減低，更多的HEp2細(xì)胞處于G0/G1靜止期，細(xì)胞凋亡明顯增加，同時(shí)抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)論Fascin基因沉默能抑制HEp2細(xì)胞的生長和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

鱗癌 Fascin基因 RNA干擾

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of Fascin gene on biological behavior of human laryngeal cancer cell line HEp2 by RNA interfering technique．MethodsFascin-targeted small interfering double-stranded RNAs(SiRNA)were transfected into HEp2 cells by lipofectamine．Fascin mRNA and protein levels were determined by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blot;cell proliferation viability was tested by MTT assay;cell cycle and apoptosis were examined by flow cytometry(FACS),tumor cell invasion ability was tested by matrigel invasion assay．ResultsRNA interference markedly inhibited the expression of Fascin mRNA and protein．Compared the parental HEp2 cells,the RNA interfered(RNAi)cells exhibited a slower rate of growth．FACS analysis revealed that cell cycle was arrested in the G0/G1phase and the apoptotic cell fraction was increased;the tumor cell invasion ability was inhibited significantly．ConclusionsFascin gene silencing suppresses the growth and invasion ability of HEp2 cells,and induces apoptosis．

Fascin是一種細(xì)胞骨架蛋白，能促進(jìn)細(xì)胞膜的突起并增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。其在間葉及神經(jīng)組織中表達(dá)較高，在成熟的上皮組織中表達(dá)低水平或缺失。在很多癌組織中，F(xiàn)ascin表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力相關(guān)[1]。本實(shí)驗(yàn)通過小RNA干擾鱗癌細(xì)胞株HEp2 Fascin基因的表達(dá)，以此觀察其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，探討Fascin基因在腫瘤中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與培養(yǎng)條件 HEp2細(xì)胞株（購于中科院細(xì)胞所）在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 RT-PCR檢測 Trizol試劑（上海生工公司）提取細(xì)胞總RNA，cDNA合成按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Invitrogen公司）操作說明書進(jìn)行，PCR擴(kuò)增Fascin mRNA，并以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照，引物由primer5.0軟件設(shè)計(jì)，上海生工公司合成，F(xiàn)ascin引物：上游5′-AGG CGG CCA ACG AGA GGA AC-3′，下游5′-ACG ATG ATG GGG CGG TTG AT-3′，產(chǎn)物長度364bp；GAPDH引物：上游5′-AAC GGA TTT GG TCG TAT TG-3′，下游5′-GGA AGA TGG TGA TGG GAT T -3′，產(chǎn)物長度208bp；反應(yīng)條件：95℃10min變性；再95℃ 30s，54℃ 1min，72℃ 1min，26個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。Taq酶為美國Promega公司產(chǎn)品，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳分離后，溴乙錠染色，紫外燈下觀察。1.3 免疫印跡法 細(xì)胞生長至接近匯合，收集細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗后，加入細(xì)胞裂解緩沖液，提取總蛋白，蛋白定量按BCA試劑盒（美國Pierce公司）說明書進(jìn)行。根據(jù)蛋白相對分子量選用合適濃度的膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）變性電泳。電泳完畢，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入相應(yīng)的一抗，37℃孵育1h，洗滌后加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，最后用ECL法試劑盒（美國Pierce公司）按產(chǎn)品說明書步驟顯色。條帶用Pro Analyzer4.0軟件進(jìn)行積分吸光度（IA）分析，以β-actin作為內(nèi)參。一抗：小鼠抗人Fascin單克隆抗體（丹麥Dako公司）工作濃度1:500，鼠抗人β-actin單克隆抗體（美國Sigma公司），工作濃度1∶1 000；過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于上海鼎國公司，工作濃度1∶2 000。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測（FACS） 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，用冷檸檬酸緩沖液固定30 min，溴化丙啶染色后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡情況，增殖指數(shù)（PI）=（S+G2/ M）/（G0/G1+S+G2/M）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞體外增殖 細(xì)胞消化后，按1 000個(gè)/孔密度接種于96孔板中，到待測時(shí)間點(diǎn)時(shí)按培養(yǎng)液量的10%加入5mg/ml的四甲偶氮唑藍(lán)（MTT）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，用DMSO（上海生工公司）溶解并在酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Molecular Devices公司）上讀取吸光值（A），測定波長490nm，每個(gè)樣本做4個(gè)復(fù)孔取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 RNAi沉默 Fascin mRNA的表達(dá) 特異針對Fascin基因（美國Santa cruz公司，商品號(hào)sc-35359）及非特異性陰性對照雙鏈小RNA（SiRNA，美國Santa cruz公司）的轉(zhuǎn)染方法按試劑說明書進(jìn)行，簡單描述如下：細(xì)胞生長于6孔板至60%～70%匯合，用無血清培液靜止24h，5μl的SiRNA于5μl RNA干擾轉(zhuǎn)染試劑（美國Santa cruz公司）混合于190μl的無血清的RPMI-1640培液，靜置30min后滴加到培養(yǎng)皿中，孵育6h后，添加10%胎牛血清的培液繼續(xù)孵育24h，用于實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)分組如下：轉(zhuǎn)染了特異針對Fascin基因小RNA的HEp2細(xì)胞為RNA干擾組，轉(zhuǎn)染了非特異性陰性對照雙鏈小RNA的HEp2細(xì)胞為干擾對照組，由未添加任何RNA的RNA干擾轉(zhuǎn)染試劑處理的HEp2細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染組。

1.7 Matrigel體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) （1）取生長旺盛的HEp2細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，經(jīng)吹打、收集、離心，用含10%小牛血清的培養(yǎng)液配成1×105/ml的細(xì)胞懸液。按每室0.3ml接種于Matrigel侵襲腔的上層；在其下層加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液0.8ml。（2）37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。（3）輕輕吸去上層培養(yǎng)液，加入含不同濃度去甲斑蝥素的培養(yǎng)液0.3ml，每一濃度復(fù)設(shè)3室，對照組加入等量不含藥物的培養(yǎng)液，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)72h。（4）取出濾膜，德克薩斯紅染色，隨機(jī)觀察5個(gè)視野（×100），細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)視野平均數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾Fascin基因的效率鑒定 用特異針對Fascin基因的干擾序列能有效沉默F(xiàn)ascin基因的表達(dá)，F(xiàn)ascin干擾組中用PCR方法未檢測出明顯的Fascin mRNA的表達(dá)，而干擾對照組與未轉(zhuǎn)染組均可見明顯的PCR產(chǎn)物條帶（圖1）；Fascin干擾組Fascin蛋白水平為未轉(zhuǎn)染組的26.48%（P＜0.01），F(xiàn)ascin干擾對照組與未轉(zhuǎn)染組相比未見明顯差異（P＞0.05）（圖2）。

圖1 RT-PCR電泳圖（1：RNA干擾組，2：干擾對照組，3：未轉(zhuǎn)染組，下同）

圖2 Westernblot檢測的柱狀圖

2.2 RNAi對HEp2細(xì)胞體外增殖能力的影響 通過雙鏈小RNA靶向沉默F(xiàn)ascin基因的表達(dá)后，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長到4d進(jìn)入生長平臺(tái)期，干擾對照組與未轉(zhuǎn)染組之間未見明顯差異，干擾組HEp2細(xì)胞體外增殖能力明顯減弱，干擾組生長第2天開始，其吸光值（A）明顯低于干擾對照組和未轉(zhuǎn)染組（均P＜0.01）（圖3）。

2.3 RNAi對HEp2細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示（表1），RNA干擾Fascin基因的表達(dá)能使更多的HEp2細(xì)胞處于G0/G1靜止期，增殖指數(shù)為0.35，明顯低于未轉(zhuǎn)染組和干擾對照組（均P＜0.01），未轉(zhuǎn)染組與干擾對照組未見明顯差別（P＞0.05）。而且RNA干擾組的細(xì)胞凋亡明顯增加，高于未轉(zhuǎn)染組和干擾對照組（均P＜0.01），未轉(zhuǎn)染組與干擾對照組未見明顯差別（P＞0.05）。

圖3 MTT法檢測細(xì)胞生長的折線圖

表1 RNAi對HEp2細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響

2.4 RNAi對HEp2細(xì)胞體外侵襲能力的影響 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)顯示（圖4），3組細(xì)胞均能夠穿過鋪有人工基質(zhì)Matrigel的濾膜，RNA干擾Fascin基因的表達(dá)能夠顯著抑制HEp2細(xì)胞的侵襲能力，穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)為（37.13±11.24），明顯低于未轉(zhuǎn)染組（133.02±21.87）和干擾對照組（142.15±23.16），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），未轉(zhuǎn)染組與干擾對照組未見明顯差別（P＞0.05）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素參與的、多步驟的復(fù)雜過程，目前已知許多基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，深入了解腫瘤發(fā)生機(jī)制是推動(dòng)腫瘤預(yù)防和治療發(fā)展的關(guān)鍵。Fascin蛋白是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特、進(jìn)化保守的細(xì)胞骨架蛋白，可與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合，定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶邊緣的絲狀偽足、微棘的核心肌動(dòng)蛋白束中，其可能在細(xì)胞遷移、粘附及信息傳遞中發(fā)揮重要作用[1]。

近年來的研究表明，F(xiàn)ascin在多種上皮源性的腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)[1]，而且在許多腫瘤組織中的表達(dá)明顯增加，例如口腔鱗癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等[2-5]，說明其在上皮性腫瘤中的表達(dá)上調(diào)具有普遍性，并且臨床研究顯示其高表達(dá)與腫瘤的浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TMN分期及臨床預(yù)后等因素相關(guān)，表明Fascin基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。

圖4 Matrigel體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的柱狀圖

本實(shí)驗(yàn)用小RNA干擾的方法來沉默F(xiàn)ascin基因的表達(dá)，來探討其對鱗癌細(xì)胞株HEp2的細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。用雙鏈小RNA能夠成功靶向沉默HEp2細(xì)胞株中Fascin基因的表達(dá)，RNA干擾后，腫瘤細(xì)胞的體外生長能力能夠被明顯抑制。流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果顯示，RNA干擾能使更多的腫瘤細(xì)胞停滯于G0/G1靜止期，而且細(xì)胞凋亡也相應(yīng)增加，說明這種對生長的抑制作用可能既與細(xì)胞周期的調(diào)控相關(guān)，也與促進(jìn)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示沉默F(xiàn)ascin的表達(dá)，同樣也可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，說明RNA干擾Fascin基因在一定程度上能夠抑制鱗癌在體外的惡性表型，但其中具體的機(jī)制目前還不是非常明了。

許多研究報(bào)道Fascin作為一個(gè)細(xì)胞骨架蛋白同時(shí)還參與了細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，例如Fascin可以通過細(xì)胞黏附的改變而影響細(xì)胞的信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[6]。Alam等[7]的研究顯示使口腔鱗癌細(xì)胞的Fascin基因過表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)和體外的生長能力，并且這種促腫瘤的機(jī)制與MAPK和Akt信號(hào)通路的激活相關(guān)。乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascin可以下調(diào)乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子BRMS1的表達(dá)和向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力[8]。因此，F(xiàn)ascin基因影響鱗癌細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制也可能與Fascin基因表達(dá)改變后，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的復(fù)雜生物信號(hào)通路活性變化有關(guān)，但還需進(jìn)一步深入研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，運(yùn)用RNA干擾的方法能有效下調(diào)Fascin基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞體外生長能力和侵襲能力，這為將來鱗癌的分子生物治療發(fā)展提供一定的借鑒。

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Effect of FASCIN gene silencing on biologic behavior of HEp2 cells

Laryngeal neoplasm Fascin RNA interference

2012-11-20）

（本文編輯：楊麗）

315031 寧波市臨床病理診斷中心（孔靜萍）；湖州市中心醫(yī)院病理科（顧棟樺）

顧棟樺，E-mail：donghuagu@live.com