李彬斐 鄭昌華 王希佳 陳亨平 張小羅

LRRK2基因G2385R突變與帕金森病相關(guān)性研究

李彬斐 鄭昌華 王希佳 陳亨平 張小羅

目的探討LRRK2基因G2385R突變與中國(guó)沿海地區(qū)漢族人群帕金森?。≒D）相關(guān)性，分析LRRK2基因多態(tài)在PD發(fā)病中的作用。方法收集PD患者197例（PD組）、健康對(duì)照者202例（對(duì)照組）的臨床資料與基因組DNA。檢測(cè)PD患者G2385R基因型；測(cè)定變異攜帶者及非攜帶者DNA序列。分析G2385R基因型在PD組和對(duì)照組中分布頻率及其與性別、年齡相互作用，統(tǒng)計(jì)G2385R變異人群歸因危險(xiǎn)度百分比。結(jié)果PD組[19例（9．64%）]患者GA基因型高于對(duì)照組[5例（2．48%）]（χ2=9．07，P＜0．01，OR=5．04，95%CI=2．16～11．78）。人群歸因危險(xiǎn)度百分比7．82%。未發(fā)現(xiàn)AA基因型。晚發(fā)型PD患者GA基因型為9．80%，與對(duì)照組（2．23%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01，OR=4．35，95%CI=1．76～12．93）。攜帶G2385R患者與非攜帶患者臨床表型在性別、發(fā)病年齡、臨床癥狀、UPDRS評(píng)分及Hoehn-Yahr分級(jí)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05）。結(jié)論LRRK2基因G2385R變異在中國(guó)沿海地區(qū)漢族人群中與晚發(fā)性PD相關(guān)，存在不同地區(qū)差異。

帕金森病 G2385R基因型 單核苷酸

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the association between G2385R polymorphisms of LRRK2 gene and Parkinson's disease(PD)．MethodsThe clinical data and peripheral blood samples were collected from 197 PD patients and 202 healthy subjects．Polymerase Chain Reaction combined with restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to detected the G2385R genotypes of PD patients,the G2385R genotype was verified by the sequencing．The sex,age,clinical symptoms, UPDRS score and Hoehn-Yahr grade were compared among PD patients with different genotypes．The frequencies of genotype distribution of PD patients and healthy subjects were compared．The population attributable risk percent(PAR%)of G2385R variations was counted and the synergy with gender and age interaction was analyzed．ResultsThe genotype GA of G2385R was detected in 19 cases of PD(9．64%),while that was detected in 5 controls(2．48%)(χ2=9．07,P＜0．01,OR=5．04,95%CI:2．16～11．78) and the PAR%of 7．82%was gained．No PD patient with AA genotype was found．The genotype GA was detected in 15 cases of late-onset PD(9．80%),in the age-matched controls,there were only 4 subjects of GA genotype(2．23%)(P＜0．01,OR=4．35,95% CI:1．76～12．93)．There were no significant differences in clinical phenotypes(sex,age,clinical symptoms,UPDRS score and Hoehn-Yahr grade）between patients carrying G2385R and those not carrying．ConclusionThe G2385R variant in LRRK2 gene may be a risk factor of the late-onset Parkinson's disease in Han Chinese patients．

帕金森?。≒D）是常見神經(jīng)系統(tǒng)變性病，其病因、發(fā)病機(jī)制尚未明確。LRRK2基因突變出現(xiàn)在家族性帕金森綜合征頻率很高，其變異具有種族差異[1-2]。LRRK2基因G2385R突變主要在亞洲人群中，在新加坡、中國(guó)大陸和臺(tái)灣地區(qū)人群以及日本、韓國(guó)的獨(dú)立研究中均發(fā)現(xiàn)G2385R與PD發(fā)病相關(guān)[3]。目前在中國(guó)有關(guān)G2385R基因型與PD相關(guān)性研究報(bào)道來自上海及四川[4-5]，關(guān)于中國(guó)沿海地區(qū)人群G2385R基因型與PD發(fā)病關(guān)系鮮有報(bào)道。本文通過中國(guó)沿海地區(qū)人群LRRK2基因G2385R突變型病例對(duì)照研究，探討LRRK2基因多態(tài)在中國(guó)沿海地區(qū)漢族人群PD發(fā)病中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集溫嶺市中醫(yī)院及溫嶺市第一人民醫(yī)院2009-03—2011-10門診及住院PD患者197例為PD組（溫嶺市中醫(yī)院107例，溫嶺市第一人民醫(yī)院90例）。男117例，女80例，年齡29～81（60.3±11.5）歲，發(fā)病年齡15～82（57.1±11.4）歲。其中早發(fā)PD（發(fā)病年齡≤50歲，EOPD組）者44例，發(fā)病年齡15～50歲（43.4±6.5）歲。晚發(fā)PD（發(fā)病年齡＞50歲，LOPD組）153例，發(fā)病年齡51～82（64.8±7.4）歲。所有患者根據(jù)英國(guó)BrainBank標(biāo)準(zhǔn)確診為PD，由專人詳細(xì)記錄并核實(shí)患者的發(fā)病年齡、發(fā)病癥狀及治療反應(yīng)，實(shí)行UPDRS評(píng)分及Hoehn-Yahr分級(jí)。溫嶺市中醫(yī)院同期健康體檢202例為對(duì)照組，男105例，女97例，年齡19～81（58.2±11.8）歲；202例中包括PD患者的健康配偶27例。所有受試者彼此間無血緣關(guān)系，且一級(jí)親屬中無PD患者。兩組研究對(duì)象在性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，并獲得入選者及監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 采用DNA提取純化試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Promega公司），Big-dye v3.1測(cè)序試劑盒（美國(guó)ABI公司），DYY-Ⅳ型電泳儀槽（北京六一儀器廠），L-21M高速冷凍離心機(jī)（上海賽特湘儀器公司）進(jìn)行標(biāo)本處理。取外周靜脈血樣本2ml（含ACD抗凝劑0.4m1）加入3ml紅細(xì)胞裂解液混勻，室溫5min，1 000r/min離心2min，移去上清液，留約100μl殘留液，搖勻使白細(xì)胞重新懸浮，5 000r/min離心2min，吸去上清液，收集白細(xì)胞懸浮液50μl。

1.2.2 基因組DNA提取及純化 按照DNA提取純化試劑盒操作步驟，結(jié)果采用凝膠電泳檢測(cè)，紫外儀觀察DNA大小，D2 000 Marker標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI及 ensembl基因庫中G2385R所在Exon48的DNA序列，設(shè)計(jì)G2385R引物序列，上游PF：5′-TAGCCCTGTTGTGGAAGTG-3′；下游PR：5′-TTCAGAGGAAGAAAGGAAG-3′。反應(yīng)體系：10×緩沖液2.5μl，50pmol/μl上下游引物0.5μl，20mmol/L dNTP0.5μl，DNA模板100ng，TaqDNA酶0.5μl，去離子水補(bǔ)至25μl。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min，然后94℃30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸15min。結(jié)果取5μl PCR產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠，觀察產(chǎn)物片段大小170bp。

1.2.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 （1）酶切反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物16μl，10×緩沖液2μl，AccI酶5U，加雙蒸水至30μl。37℃酶切過夜24h。結(jié)果取5μl PCR產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠，紫外儀觀察。（2）基因型分析。GG型純合子170bp（野生型、沒有酶切位點(diǎn)）；GA型雜合子170bp+123bp；AA型純合子123bp。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序 由北京奧康生物技術(shù)公司完成，PCR產(chǎn)物用Qiaquick柱（Oiagen公司）過柱純化并定量。Big-dye v3.1測(cè)序kit對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為單向引物。5μl反應(yīng)體系中含待測(cè)模板150ng、單向引物3.2pmol、Big-dye v3.1mix 0.5μl。ABI 9700型擴(kuò)增儀反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行純化，加入高純Hi-Di甲酰胺10μl溶解，ABI 3730基因測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)序列與基因組LRRK2基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，驗(yàn)證入選人群是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律分別采用χ2、t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LRRK2基因G2385R基因型的檢測(cè) LRRK2基因G2385R擴(kuò)增產(chǎn)物為170bp，經(jīng)AccI酶切后，G等位基因無酶切位點(diǎn)仍為170bp片段；A等位基因切為123bp和47bp兩個(gè)片段，47bp條帶泳出凝膠未能顯示；GG基因型為單個(gè)170bp；GA基因型為170bp、123bp兩個(gè)條帶，AA基因型為123bp單個(gè)條帶。

2.2 LRRK2基因G2385R位點(diǎn)序列測(cè)定 測(cè)序結(jié)果見圖1。

圖1 LRRK2基因G2385R（C.7153G＞A）SNP位點(diǎn)測(cè)序圖（上圖為正常序列，下圖為雜合序列）

2.3 PD組和對(duì)照組G2385R基因型和等位基因檢測(cè)結(jié)果 將PD組分為男性PD組和女性PD組、EOPD組和LOPD組，將對(duì)照組分為男性對(duì)照組和女性對(duì)照組、EOPD對(duì)照組和LOPD對(duì)照組，分別比較LRRK2基因G2385R基因型頻率和等位基因頻率，見表1。

由表1可見，PD組中，LRRK2基因G2385R雜合攜帶者19例，GA基因型頻率9.64%，A等位基因頻率4.82%；對(duì)照組中LRRK2基因G2385R雜合攜帶者5例，GA基因型頻率2.48%，A等位基因頻率1.24%。所有研究對(duì)象均未檢測(cè)出AA基因型。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)表明PD組與對(duì)照組基因型觀測(cè)值與期望值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（PD組χ2=0.84，P＞0.05；對(duì)照組χ2=0.03，P＞0.05）。PD組的基因型及等位基因頻率變異均明顯高于對(duì)照組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ22=9.07，P＜0.01；χ2=8.79，P＜0.01）?；蛐图暗任换蝾l率在PD組與對(duì)照組、男性PD組與男性對(duì)照組、女性PD組與女生對(duì)照組、LOPD組與LOPD對(duì)照組比較，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而EOPD組與EOPD對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 G2385R基因型頻率和等位基因頻率分布[例（%）]

2.4 G2385R多態(tài)的單因素Logistic回歸分析 見表2。

表2 G2385R多態(tài)的單因素Logistic回歸分析[例（%）]

由表2可見，攜帶GA基因型者在男性PD組中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶者4.04倍，在女性PD組中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶者6.73倍。LOPD組中，GA基因型的PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶者4.35倍。

2.5 G2385R、性別、起病年齡及其相互作用的多因素Logistic回歸分析 見表3。

表3 G2385R、性別、起病年齡及其相互作用的多因素Logistic回歸分析

由表3可見，Logistic分析經(jīng)過性別、起病年齡校正后，G2385R變異攜帶者PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶者5.04倍（P＜0.01）。

2.6 LRRK2基因G2385R人群歸因危險(xiǎn)度百分比 采用G2385R變異OR值作為相對(duì)危險(xiǎn)度估計(jì)值，對(duì)照組中G2385R變異（即GA+AA基因型）頻率作為一般人群風(fēng)險(xiǎn)基因型頻率，估算出G2385R變異人群歸因危險(xiǎn)度百分比（PAR%）為7.82%。

2.7 基因型同臨床表型關(guān)系 見表4。

表4 G2385R變異攜帶者和非攜帶者的臨床特征比較

由表4可見，G2385R變異攜帶者和非攜帶者臨床特征比較，在性別、起病年齡、起病時(shí)癥狀、UPDRS評(píng)分和Hoehn and Yahr評(píng)級(jí)等方面，攜帶者與非攜帶者差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

G2385R被報(bào)道是第一個(gè)中國(guó)人特異的PD可能風(fēng)險(xiǎn)因子[4-5]。易感基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，有3種可能：（1）等位基因通過改變氨基酸序列或穩(wěn)定性等影響基因功能，進(jìn)而影響發(fā)病危險(xiǎn)性；（2）等位基因與實(shí)際引起疾病基因位點(diǎn)連鎖不平衡；（3）假陽性（Ⅰ型錯(cuò)誤）[5-6]。本研究結(jié)果G2385R變異與中國(guó)沿海地區(qū)漢族人群散發(fā)性PD發(fā)病密切相關(guān)，可增加PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與以前研究相同[4-6]。多因素Logistic回歸分析顯示，變異攜帶者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)于非攜帶者是5.04倍，與中國(guó)大陸其他地區(qū)研究結(jié)果相比存在以下差別：首先，An[4]報(bào)道四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就醫(yī)PD患者中G2385R變異頻率11.8%，對(duì)照組3.3%；Li[5]報(bào)道G2385R上海瑞金醫(yī)院門診就診PD患者中的頻率5.96%，對(duì)照組為0，兩者在PD組及對(duì)照組中分布頻率差異均較大。本研究顯示G2385R變異頻率在PD中9.64%，對(duì)照組中2.48%。其次，An[4]報(bào)道G2385R變異在年輕人群及年老人群均同PD相關(guān)，其中ELPD組發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比LOPD組高。Li等[5]報(bào)道兩者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無差別。本研究數(shù)據(jù)G2385R變異在年輕人群中與PD無相關(guān)，與年老人群PD發(fā)病具有相關(guān)性，是沿海地區(qū)漢族人群LOPD可能風(fēng)險(xiǎn)因子。第三，Li等[5]報(bào)道G2385R變異分布頻率女性患者明顯高于男性患者，性別與年齡在PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中具有交互作用。本研究結(jié)果G2385R變異頻率在男性患者及女性患者差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，性別與年齡在PD發(fā)病中無交互作用。本研究和大陸以前研究存在差別原因可能為以下情況，中國(guó)大陸不同地區(qū)種族、環(huán)境、生活習(xí)俗差別較大。本研究對(duì)象來自中國(guó)大陸浙江省溫嶺市，溫嶺市為中小城市，相對(duì)上海、成都等大城市較少外來移民，同其他地區(qū)通婚也較少，研究對(duì)象同質(zhì)性較高，同時(shí)生活習(xí)俗同其他地區(qū)差異較大，因此出現(xiàn)以上差別。

本文根據(jù)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)OR值作為相當(dāng)危險(xiǎn)度RR，對(duì)照組風(fēng)險(xiǎn)基因頻率作為一般人群總的暴露率，計(jì)算出G2385R人群歸因危險(xiǎn)度百分比（PAR%）為7.82%，高于國(guó)外研究結(jié)果[6]。人群歸因危險(xiǎn)度百分比是總體人群中某種疾病歸因于某種因素暴露所引起發(fā)病占全部發(fā)病比例，消除這個(gè)危險(xiǎn)因素后，所產(chǎn)生對(duì)預(yù)防該疾病的效果將占有多大比重。目前中國(guó)55歲以上人口中有170萬PD患者，隨著人口老年化，還將繼續(xù)增加。按照本文獲得PAR%，推算出因暴露G2385R變異而發(fā)病患者數(shù)量較多，因此，研究G2385R在PD發(fā)病機(jī)制中作用，尋找針對(duì)性治療措施具有重要意義。

臨床表型方面，攜帶G2385R的PD患者與非攜帶者在性別、發(fā)病年齡、病程、臨床癥狀、UPDRS評(píng)分及Hoehn and Yahr分級(jí)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。靜止性震顫，運(yùn)動(dòng)遲緩是攜帶者常見起病癥狀，所有攜帶者對(duì)左旋多巴都有陽性反應(yīng)，是典型特發(fā)性PD癥狀，與以前報(bào)道研究相同[3-6]。來自中國(guó)大陸2份研究報(bào)道，在攜帶者起病年齡方面存在爭(zhēng)論。Li[5]報(bào)道攜帶者起病年齡相對(duì)較遲，有較長(zhǎng)病程，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；相反的，An[4]報(bào)道攜帶者起病年齡較早，尤其在LOPD組具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本文結(jié)果顯示，PD患者中攜帶者起病年齡比非攜帶者年輕，尤其LOPD組有較明顯趨勢(shì)，但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以確定G2385R變異是否影響了PD起病時(shí)間。G2385R變異攜帶者可能出現(xiàn)抗凋亡作用減弱，在基因與基因或基因與環(huán)境因素的相互作用下誘發(fā)PD。G2385R變異致病機(jī)制目前仍未清楚，需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究結(jié)果顯示G2385R變異與中國(guó)沿海地區(qū)漢族人群PD具有相關(guān)性，與早發(fā)性PD無相關(guān)性，攜帶變異患者具有典型PD臨床表現(xiàn)。

[1] Tan E K,Zhao Y,Tan L,et al．Analysis of LRRK2 Gly2385Arg genetic variant in non-Chinese Asians[J]．Mov Disord,2007,22(12): 1816-1818．

[2] Farrer M J,Stone J T,Lin C H,et al．LRRK2 G2385R is an ancestral risk factor for Parkinson'S disease in Asians[J]．Parkinsonism Relat Disord,2007,13(2):89-92．

[3] Kim J M,Lee J Y．The LRRK2 G2385R variant is a risk factor for sporadic Parkinson's disease in the Korean population[J]．Parkinsonism Relat Disord,20l0,16（2）:85-88．

[4] An X K,Peng R,Li T,et al．LRRK2 Gly2385Arg variant is a risk factor of Parkinson's disease among Han-Chinese from mainland China[J]．Eur J Neurol,2008,15(3):301-305．

[5] Li C,Ting Z,Qin X,et al．The prevalence of LRRK2 Gly2385Arg variant in Chinese Han population with Parkinson'S disease[J]．Mov Disord,2007,22(16):2439-2443．

[6] Zabetian C P,Yamamoto M,Lopez A N,et al．LRRK2 mutations and risk variants in Japanese patients with Parkinson'S disease [J]．Mov Disord,2009,24(7):1034-1041．

Association between G2385R polymorphisms of LRRK2 gene and Parkinson`s disease

Parkinson’s disease G2385R genetype Single nucleotide

2012-08-23）

（本文編輯：楊麗）

317500 溫嶺市中醫(yī)院（李彬斐、陳亨平、張小羅）；溫嶺市第一人民醫(yī)院（鄭昌華、王希佳）

鄭昌華，E-mail：zhengchanghua0402@163.com