李妍 杜紅延 李紅衛(wèi)

慢病毒載體作為一類來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以其轉(zhuǎn)染效率高，可感染分裂期和非分裂期細胞，可容納較大的基因片段等優(yōu)點，在科研領(lǐng)域有著良好的發(fā)展前景。RNA干擾現(xiàn)象從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在還不足二十年的時間里，發(fā)展迅速，被廣泛地應用于一些疾病治療的研究。越來越多的研究都將慢病毒載體運用于RNA干擾技術(shù)中，成為在基因功能研究和基因治療方面的一種有力的手段。本文主要就近年來慢病毒載體在RNA干擾技術(shù)中的應用作一綜述，討論其安全性、研究進展和發(fā)展前景。

1 慢病毒載體

1.1 慢病毒的基因結(jié)構(gòu)

慢病毒（lentivirus）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，是一種RNA病毒。慢病毒載體（lentiviral vector， LV）是通過去除慢病毒基因組中部分基因，并插入所需的目的基因和標記物構(gòu)建而成，來源于多個物種，其中以人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）為代表。HIV-1共有9個基因，兩端為長末端重復序列（long terminal repeat，LTR）。含有g(shù)ag、pol、env 等 3 個結(jié)構(gòu)基因和tat、nef、vif、rev、vpr、vpu 等 6個調(diào)節(jié)基因。其中，gag編碼內(nèi)膜蛋白、衣殼蛋白和核衣殼蛋白；pol編碼蛋白酶、整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶；env編碼gp41和gp120兩種糖蛋白。6個調(diào)節(jié)基因控制著病毒基因表達，在致病上具有重要作用：tat編碼的蛋白是HIV復制所必需的反式激活轉(zhuǎn)錄因子；rev編碼的蛋白也是HIV復制所必需的，缺乏時病毒能轉(zhuǎn)錄但是病毒晚期基因不能表達，無法產(chǎn)生子代病毒體；nef、vpr、vpu和vif編碼的產(chǎn)物不是必需的，但在體內(nèi)會影響病毒毒力。

1.2 慢病毒載體的構(gòu)建

以HIV-1來源為代表的慢病毒載體由載體成分和包裝成分組成。載體成分含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用元件, 同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點，以及在此位點插入的外源目的基因。包裝成分則含有編碼產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白的結(jié)構(gòu)基因。第三代慢病毒載體應用最廣泛，它包含了4種質(zhì)粒，一個是載體成分，另外三個是包裝成分，分別含有基因gag-pol、env和rev。包膜蛋白大多來自水泡性口炎病毒包膜蛋白（vesicular stomatitis virus G-protein，VSV-G），用VSV-G代替HIV-1的包膜蛋白使病毒感染細胞能力增強，擴大了宿主細胞范圍。四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，可獲得高滴度、高感染力而不能復制的安全性較高的慢病毒載體[1]。

為提高慢病毒載體的生物安全性，還需對其進行優(yōu)化。自身失活慢病毒載體的構(gòu)建是將載體3'端LTR中的U3區(qū)增強子和啟動子序列去除,導致病毒RNA不能轉(zhuǎn)錄[2]，因此該系統(tǒng)的安全性更高。Zufferey等[3]將 HIV 的env、vif、vpr、vpu和nef 基因去除后，載體能夠轉(zhuǎn)染靜止期細胞和單核細胞來源的巨噬細胞，而且能夠在體內(nèi)有效地轉(zhuǎn)導神經(jīng)元。這種優(yōu)化的載體在保留感染非分裂期細胞特性的同時提高了其生物安全性。

1.3 慢病毒載體的優(yōu)勢

慢病毒載體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體等相比，具有以下的優(yōu)點[1]：（1）轉(zhuǎn)染效率高，可以感染分裂期細胞和非分裂期細胞，例如神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、造血系統(tǒng)等的非分裂期細胞，免疫反應小；（2）可轉(zhuǎn)移基因片段較大，可插入10 kb左右的基因片段；（3）慢病毒基因組被分成四質(zhì)粒系統(tǒng)，顯著降低了產(chǎn)生有復制能力的病毒（replication competent virus，RCV）的可能性；（4）目的基因與宿主基因組整合，實現(xiàn)目的基因的較長時間表達。

1.4 慢病毒載體的安全性

慢病毒載體的發(fā)展迅速，應用廣泛，但對于某些特定運用慢病毒載體進行轉(zhuǎn)導仍需要對某些因素進行改良，以提高基因轉(zhuǎn)導的效率。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體的安全性一直受到關(guān)注。

曾有臨床研究發(fā)現(xiàn)，在接受以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的基因治療的X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征的患者中，出現(xiàn)白血病的病例[4]。還有報道2例接受基因治療的X連鎖慢性肉芽腫病患者骨髓異常增生[5]。通過研究發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合到原癌基因的啟動子附近，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的LTR作為強有力的增強因子，激活了附近的原癌基因使其異常表達。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，慢病毒載體的安全性有所提高。Montini等[6]使用Cdkn2a–/–鼠移植模型研究發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體會引起細胞癌變加速，然而對于慢病毒載體，即使插入較大的基因序列或者在細胞中大量表達，都不會影響腫瘤的發(fā)生。這很可能是因為自身失活慢病毒載體缺失病毒LTR中的增強子和啟動子；另一方面，可能由于慢病毒載體與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入整合位點的不同所致。這些研究的結(jié)果表明慢病毒載體，尤其是自身失活慢病毒載體較其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的安全性更高。從轉(zhuǎn)導高效性以及疾病治療的有效性看，慢病毒載體都顯示其良好的發(fā)展前景。

2 慢病毒載體在RNA干擾技術(shù)中的應用

2.1 RNA干擾技術(shù)

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）其機制是通過抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯來抑制基因表達。將與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA導入細胞中，雙鏈RNA先降解為siRNA，隨后siRNA與一些蛋白合成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），引發(fā)靶mRNA降解而導致基因表達沉默。RNAi作用機制具有普遍性、特異性、高效性、位置效應等特點。在沉默基因的表達方面，因為任何導致或者促進疾病發(fā)生的蛋白質(zhì)都容易受RNAi影響，所以RNAi比傳統(tǒng)的藥物更具有特異性和靈活性，已被廣泛應用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。將慢病毒載體作為RNAi技術(shù)的載體，可以結(jié)合兩者優(yōu)勢，特異性抑制哺乳動物的各類細胞中基因的表達，成為基因功能研究和基因治療的有力手段[7]。

2.2 在病毒感染疾病方面

對病毒引起的疾病治療，應從阻斷病毒感染途徑、抑制病毒復制和蛋白表達的方面著手。利用慢病毒載體能感染分裂期和非分裂期細胞、轉(zhuǎn)染效率高等特點，結(jié)合RNAi技術(shù)，可抑制和阻斷人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、柯薩奇病毒等在人體內(nèi)的感染。

對于AIDS的治療方法，目前有一種高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（highly active antiretroviral therapy，HAART），通過多種抗病毒藥物聯(lián)合使用來緩解病情，但是并不能徹底治愈，還可能導致長期的毒性作用并可能產(chǎn)生耐藥性病毒變異體。Centlivre等[8]建立RNAi的慢病毒載體，導入到人類造血干細胞中，在“人類免疫系統(tǒng)”（human immune system）BALB/c Rag2-/-IL-2Rγc-/-小鼠模型中表達抗病毒的shRNA，能提高體內(nèi)免疫系統(tǒng)中細胞的多向分化能力，并形成不受HIV-1復制影響的CD4+T細胞。由于單獨使用一種抗HIV-1的shRNA會引起靶基因序列出現(xiàn)變異而產(chǎn)生RNAi逃避變異體，而且HIV-1可以改變其靶mRNA的結(jié)構(gòu)。為此，可以構(gòu)建含有多個病毒序列的組合性RNAi攻擊病毒，例如多重shRNA，miRNA樣的多順反子以及e-shRNA。首先在體外構(gòu)建含有抗HIV-1的shRNA或miRNA的慢病毒載體，導入CD34+造血干細胞，隨后將細胞導入病人體內(nèi)。這些CD34+細胞能使抗HIV-1的髓樣和淋巴樣細胞群增多，以增強細胞抵抗HIV-1的能力[9]。

乙型肝炎在我國廣泛流行，嚴重影響患者肝功能，而且容易導致肝硬化、肝癌，為此研究有效預防和治療乙肝的方法是關(guān)鍵。羅祥基等[10]通過構(gòu)建HBs基因RNAi慢病毒載體感染肝癌細胞。根據(jù)實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)HBV DNA和HBsAg表達顯著下降，說明構(gòu)建HBs基因RNAi慢病毒載體抑制HBV的復制和抗原表達的作用顯著，為乙型肝炎的治療提供了一個新的平臺。

2.3 在癌癥方面

癌癥的發(fā)生主要與基因突變有關(guān)，尤其是與癌基因的激活有關(guān)，有突變、基因擴增和染色體重排3種激活機制。目前主要通過手術(shù)、放療和化療等手段進行治療?；蛑委熥鳛橐环N新的方法正處于快速發(fā)展階段，其中RNAi技術(shù)已經(jīng)成為一種全新的癌癥治療方法，再加上慢病毒載體能夠感染分裂期和非分裂期細胞等特性，在鼻咽癌、宮頸癌、白血病、肝癌等多種癌癥研究中起著重要的作用。

Nagaraja等[11]使用慢病毒載體介導的RNAi技術(shù)，特異性地使Hsp-25或Hsp-27基因表達沉默，能夠促進PA28α蛋白的合成，增強蛋白酶體的活性，從而提高抗原提呈能力，消除腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能，增強CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力和記憶能力。除了通過提高機體自身對腫瘤細胞的殺傷能力，許多實驗還通過構(gòu)建致癌基因的RNAi慢病毒載體，抑制腫瘤生長或誘導腫瘤細胞凋亡。例如敲除MYCN可以明顯有效地抑制人成神經(jīng)細胞瘤生長[12]；干擾Caveolin-1 mRNA并抑制Caveolin-1蛋白表達，能有效地抑制體外和小鼠體內(nèi)下咽鱗狀細胞癌的生長[13]；慢病毒載體介導的RNAi，顯著抑制CXCR4在體內(nèi)和體外口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達，CXCR4的減少促進細胞周期的停滯、腫瘤細胞的凋亡和阻止腫瘤的生長，同時改變了許多相關(guān)基因的表達，提示CXCR4可成為腫瘤基因治療的一個新靶點[14]。

另外一個方面，在腫瘤的治療過程中，對化療藥物和放射性療法的耐受性也是一個不容忽視的問題。目前發(fā)現(xiàn)慢病毒載體介導的RNAi技術(shù)對該問題的解決具有一定的潛力?；熓悄壳爸委熌[瘤的主要方法之一，由于治療過程中腫瘤細胞會產(chǎn)生多重耐藥性（multiple-drug resistance，MDR），給疾病的治療帶來了困難。引起多重耐藥性的原因很多，其中MDR1基因編碼的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）起著主要作用。P-gp具有能量依賴性“藥泵”功能，P-gp既能與藥物結(jié)合，又能與ATP結(jié)合，ATP供能，使細胞內(nèi)藥物泵出細胞外，減低了細胞內(nèi)的藥物濃度，從而使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性?？梢酝ㄟ^構(gòu)建RNAi慢病毒載體，顯著降低MDR1基因和P-gp在多重耐藥性白血病細胞系中的表達，結(jié)果恢復了腫瘤細胞對化學藥物的敏感性[15]。腫瘤耐藥性低，對藥物敏感，提高了非霍奇金淋巴瘤、白血病等腫瘤化療的療效。胰島素樣生長因子受體1（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）的過度表達與惡性腫瘤細胞的生長以及對放療和化療的抵抗性有關(guān)。Wang等[16]通過慢病毒介導的shRNA靶向IGF-1R并結(jié)合化療，能夠有效抑制體內(nèi)和體外的骨肉瘤細胞的生長，同時還增強了Caspase-3介導腫瘤細胞凋亡的作用。可見，慢病毒載體介導的RNAi技術(shù)成為抗癌治療的一種具有潛力的手段。

2.4 在心血管疾病方面

目前許多心血管疾病的病因仍不是非常清楚，通過RNAi慢病毒載體，在研究相關(guān)疾病的病因與發(fā)病機制方面起著越來越重要的作用。

心肌細胞凋亡可以清除衰老損傷細胞，也可引起機體穩(wěn)態(tài)失調(diào)，導致心血管疾病的發(fā)生。近年來,人們運用RNAi技術(shù)，從影響心肌細胞凋亡的各種因子及其作用著手,研究心血管疾病的發(fā)病機制，從而探索更好的治療方法。劉彬等[17]構(gòu)建靶向抑制大鼠凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1）RNAi慢病毒載體，從實驗中可以發(fā)現(xiàn)抑制LOX-1能減輕H2O2誘導的心肌細胞凋亡。說明LOX-1可能在H2O2誘導的心肌細胞損傷中發(fā)揮著重要作用。

腦組織缺血缺氧時會導致細胞自噬[18]，而Beclin-1的作用是促進自噬。將靶向編碼Beclin-1基因的RNAi慢病毒載體，導入大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的大鼠模型，抑制Beclin-1的表達，能使神經(jīng)前體細胞、成熟與未成熟神經(jīng)元數(shù)量增加，并且減少缺血區(qū)域中央的神經(jīng)元凋亡以及梗死的體積。通過該種方法抑制Beclin-1的表達可以減少腦缺血時引起的組織損傷，改善腦缺血的癥狀[19]。

2.5 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面

利用慢病毒載體感染非分裂期細胞的特性，慢病毒載體介導的RNAi在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中顯示出重大意義。Mazarakis等[20]用狂犬病毒包膜蛋白代替HIV-1的包膜蛋白，構(gòu)建狂犬病毒包膜蛋白假構(gòu)型慢病毒載體，利用狂犬病病毒嗜神經(jīng)性和逆向軸突運輸?shù)奶匦?，?jīng)外周或在中樞神經(jīng)系統(tǒng)注射，都可發(fā)現(xiàn)目的基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達，這就增強了慢病毒載體介導的基因治療在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的效用。肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種致命的神經(jīng)退行性疾病，會導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運動神經(jīng)元死亡，主要是編碼SOD1的基因發(fā)生突變所致。運用慢病毒載體介導的RNAi使小鼠體內(nèi)過度表達SOD1的特定基因沉默，使其表達顯著下降，實驗發(fā)現(xiàn)腦干和脊髓易感運動神經(jīng)元的壽命延長。此外，SOD1基因沉默還增強了實驗動物運動神經(jīng)元的功能，明顯延緩了ALS的發(fā)病，延長了一般的壽命[21]。

重復多次服用鎮(zhèn)痛藥、精神興奮藥、抗精神病藥等易成癮藥物會因其與中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)相互作用[22]，使機體產(chǎn)生欣快感，造成藥物成癮性。Bahi等[23]通過改變大鼠多巴胺D3受體（D3R）的表達可以改變可卡因的興奮作用，運用RNAi慢病毒載體抑制其表達可增強興奮作用，然而使其過度表達則會使興奮作用降低，提示 D3R可作為服用可卡因造成的藥物成癮性基因治療的一個重要靶點。另外，神經(jīng)興奮藥會引起中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）大量表達，以慢病毒作為載體增強或者抑制uPA的表達，可以觀察到可卡因誘導的行為改變，通過siRNAs抑制uPA的表達能夠抑制這種行為改變[24]。由此看出在藥物成癮性的治療方面慢病毒載體介導的RNAi技術(shù)將發(fā)揮重要的作用。

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease）患者大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域出現(xiàn)老年斑，其中心部分主要是由β-淀粉肽前體蛋白降解而來的β-淀粉肽，產(chǎn)生這種毒性淀粉肽需要β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌酶。Sierant等[25]建立慢病毒載體介導的RNAi以沉默大鼠腦中神經(jīng)干細胞編碼BACE1的基因，有效降低腦中β-淀粉肽的積聚，為預防和治療阿爾茨海默病提供了一種新的方法。

除此之外，該治療技術(shù)在亨廷頓舞蹈?。℉untington's disease）、帕金森?。≒arkinson's disease）等嚴重神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中也都取得了一定的成果。

3 總結(jié)與展望

近幾年來，RNAi技術(shù)被廣泛地應用于各種領(lǐng)域，包括基因功能的研究以及疾病的發(fā)病機制和治療方法的研究。但技術(shù)的實施過程中仍存在一些困難需要克服。脫靶效應（off-target effect）一直是研究的重點，也是需要克服的困難之一。雖然現(xiàn)在仍不能找到普遍通用的方法避免所有的脫靶效應，但通過2'-OMe的修飾[26]或者DNA的替換[27]可以顯著地降低脫靶效應。相信通過對RNA結(jié)構(gòu)的合理修飾和改進，這些問題終將被克服。

發(fā)展慢病毒載體介導的RNAi技術(shù)，發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的影響因素，并嘗試由此著手研究治療的方法，達到治療疾病的效果。為此還應該保證更高的安全性、有效性和可靠性，并逐步從體外實驗和動物實驗進入到臨床試驗階段，相信該技術(shù)將在今后的研究領(lǐng)域和臨床實際應用方面有著更廣闊的前景。

[1] 梁艷, 李濤, 周克元. 慢病毒載體在RNA干擾中的應用進展[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2010, 31(11): 1282-1284.

[2] 李振宇, 徐開林, 潘秀英. 慢病毒載體構(gòu)建及結(jié)構(gòu)優(yōu)化[J].國外醫(yī)學分子生物學分冊, 2002, 24(5): 310-313.

[3] Zufferey R, Nagy D, Mandel R J, et al. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo[J].Nat Biotechnol, 1997, 15(9): 871-875.

[4] Hacein-Bey-Abina S, von Kalle C, Schmidt M, et al. A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency[J]. N Engl J Med, 2003, 348(3): 255-256.

[5] Stein S, Ott M G , Schultze-Strasser S, et al. Genomic instability and myelodysplasia with monosomy 7 consequent to EVI1 activation after gene therapy for chronic granulomatous disease[J]. Nat Med, 2010, 16(2): 198-204.

[6] Montini E, Cesana D, Schmidt M, et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral Vector integration[J]. Nat Biotechnol, 2006, 24(6): 687-696.

[7] Kaur P, Nagaraja G M, Asea A. Combined lentiviral and RNAi technologies for the delivery and permanent silencing of the hsp25 gene[J]. Methods Mol Biol, 2011, 787: 121-136.

[8] Centlivre M, Legrand N, Liu Y P, et al. Preclinical test of a lentivirus-mediated RNAi gene therapy against HIV-AIDS in the humanized mouse model[J]. Retrovirology, 2011, 8(2):9-10.

[9] Liu Y P, Westerink J T, ter Brake O, et al. RNAi-inducing lentiviral vectors for anti-HIV-1 gene therapy[J]. Methods Mol Biol, 2011, 721: 293-311.

[10] 羅祥基, 程慶保, 徐峰, 等. 慢病毒介導基于microRNA系統(tǒng)的HBs RNAi技術(shù)抑制HBV復制[J]. 第二軍醫(yī)大學學報,2009, 30(3): 295-299.

[11] Nagaraja G M, Kaur P, Neumann W, et al. Silencing Hsp25/Hsp27 gene expression augments proteasome activity and increases CD8+T-cell-mediated tumor killing and memory responses[J]. Cancer Prev Res(Phila), 2012, 5(1): 122-137.

[12] Jiang R, Xue S F, Jin Z L. Stable knockdown of MYCN by lentivirus-based RNAi inhibits human neuroblastoma cells growth in vitro and in vivo[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 410(2): 364-370.

[13] Zhao X N, Ma C, Cai X L, et al. RNA interference of caveolin-1 via lentiviral vector inhibits growth of hypopharyngeal squamous cell carcinoma FaDu cells in vitro and in vivo[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2011, 12(2):397-401.

[14] Yu T, Wu Y Y, Huang Y, et al. RNAi Targeting CXCR4 Inhibits Tumor Growth Through Inducing Cell Cycle Arrest and Apoptosis[J]. Mol Ther, 2012, 20(2): 398-407.

[15] Ye X S, Liu T, Gong Y P, et al. Lentivirus-mediated RNA interference reversing the drug-resistance in MDR1 singlefactor resistant cell line K562/MDR1[J]. Leuk Res, 2009,33(8): 1114-1119.

[16] Wang Y H, Xiong J, Wang S F, et al. Lentivirus-mediated shRNA targeting insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) enhances chemosensitivity of osteosarcoma cells in vitro and in vivo[J]. Mol Cell Biochem, 2010, 341(1-2): 225-233.

[17] 劉彬, 黃佳城, 周迎春, 等. 慢病毒介導LOX-1基因RNA干擾抑制氧化應激誘導心肌細胞凋亡[J]. 南方醫(yī)科大學學報, 2012, 32(2): 165-169.

[18] Adhami F, Liao G, Morozov Y M, et al. Cerebral ischemiahypoxia induces intravascular coagulation and autophagy[J].Am J Pathol, 2006, 169(2): 566-583.

[19] Zheng Y Q, Liu J X, Li X Z, et al. RNA interferencemediated downregulation of Beclin1 attenuates cerebral is chemic injury in rats[J]. Acta Pharmacol Sin, 2009, 30(7):919-927.

[20] Mazarakis N D, Azzouz M, Rohll J B, et al. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery[J]. Hum Mol Genet, 2001, 10(19):2109-2121.

[21] Ralph G S, Radcliffe P A , Day D M, et al. Silencing mutant SOD1 using RNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an ALS model[J]. Nat Med, 2005, 11(4):429-433.

[22] Nestler E J . Genes and addiction[J]. Nature Genetics, 2000,26: 277-281.

[23] Bahi A, Boyer F, Bussard G, et al. Silencing dopamine D3-receptors in the nucleus accumbens shell in vivo induces changes in cocaine-induced hyperlocomotion[J]. Eur J Neurosci, 2005, 21(12): 3415-3426.

[24] Bahi A, Boyer F, Kafri T, et al. Silencing urokinase in the ventral tegmental area in vivo induces changes in cocaineinduced hyperlocomotion[J]. J Neurochem, 2006, 98(5):1619-1631.

[25] Sierant M, Kubiak K, Kazmierczak-Baranska J, et al. RNA interference in silencing of genes of Alzheimer's disease in cellular and rat brain models[J]. Nucleic Acids Symp Ser(oxf), 2008, (52): 41-42.

[26] Jackson A, Burchard J, Leake D, et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces ＂off-target＂transcript silencing[J]. RNA, 2006, 12(7): 1197-1205.

[27] Ui-Tei K, Naito1 Y, Zenno S, et al. Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution:modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced offtarget effect[J]. Nucleic Acids Res, 2008, 36(7): 2136-2151.