張眾李連宏 謝豐培

?綜 述?

乳腺干細(xì)胞的識別、再生、分化及其調(diào)控

張眾★李連宏 謝豐培

乳腺發(fā)育與再生取決于乳腺干細(xì)胞的再生。乳腺干細(xì)胞及其龕于乳腺導(dǎo)管發(fā)育時期分布在乳腺原基導(dǎo)管終端芽（TEB）帽區(qū)，在成體乳腺，以規(guī)則性的間距分布在整個乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)，而主要位于終末導(dǎo)管（TD）?？衫帽硇蜆?biāo)記、Sp分析及體外培養(yǎng)乳腺球形成以識別乳腺干細(xì)胞。乳腺干細(xì)胞后代的級別分化首先是雙能祖細(xì)胞，而后，腔限制性與肌限制性細(xì)胞。妊娠可誘發(fā)具自我更新性與多能性的上皮細(xì)胞亞型PI-MEC。小鼠乳腺干細(xì)胞在青春期與妊娠期分別由雌激素與孕激素調(diào)控。乳腺干/祖細(xì)胞的自我更新與分化受Wnt、Hedgehog 、Notch與TGF-beta等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)的諸多因素調(diào)控。

乳腺干細(xì)胞；再生；分化；信號調(diào)控

婦女乳腺的基本功能是哺乳，并以此為嬰兒提供生存所必需的營養(yǎng)與某些免疫物質(zhì)。母乳喂養(yǎng)促進親子間的感情交流，且有助于母體的產(chǎn)后恢復(fù)，如子宮復(fù)舊。成年女性乳房是顯現(xiàn)軀體性感與曲線美的重要器官之一。豐滿挺拔的乳房具有迷人的美學(xué)意義，女性乳房也是易患多種疾病的器官。

在人體諸多器官中，乳腺的獨特性主要為其發(fā)育是在出生后，并于青春期和妊娠期發(fā)生急劇增生和分化。在全身性激素，主要是雌激素及孕激素分泌消長的調(diào)控下，乳腺在月經(jīng)周期及妊娠、哺乳與斷奶、復(fù)舊及再次妊娠周期中發(fā)生周而復(fù)始的再生、分化與凋亡等改變。一般，器官與結(jié)構(gòu)的干細(xì)胞對局部損害發(fā)生分裂反應(yīng)，以彌補喪失的細(xì)胞。而乳腺則當(dāng)青春動情期與妊娠的特別時期需要再生大量的細(xì)胞，以形成新的組織結(jié)構(gòu)。這對乳腺干細(xì)胞及其局部微環(huán)境提出了特別的需求。

乳腺的實驗研究廣泛采用小鼠模型?；蛑苯永眯∈笕橄偕掀ぃ蜷g接地將人類乳腺上皮異種移植于小鼠，以觀察人類乳腺生物學(xué)。從分析小鼠模型中，學(xué)者們獲得了關(guān)于乳腺發(fā)育、癌變等方面的重要知識。但，小鼠與人類乳腺的發(fā)育、解剖與生理也存在某些顯著的差異。例如，小鼠乳腺的上皮管道系統(tǒng)埋于脂肪墊內(nèi)，而人類乳腺上皮的周圍是膠原化間質(zhì)；人類發(fā)育過程的乳腺上皮中有CK19陽性與CK14陽性的腔上皮，而小鼠則缺乏這種雙陽性的腔上皮細(xì)胞。這些差異提示，從小鼠模型實驗所獲得的結(jié)果不宜簡單地直接推論于人類乳腺。

1 乳腺發(fā)育

乳腺發(fā)育分為三個不同時相，即胚胎期、青春期和妊娠期/哺乳期。胚胎期人類和鼠類乳腺的發(fā)育十分相似。但人類乳腺發(fā)育比較復(fù)雜些，可分為十個階段，包括乳嵴、乳丘、乳盤、小丘、圓錐、發(fā)芽、凹入、分支、成管與端—泡各期。最早，于胚胎齡4周、胚體4～5 mm長時，胚體軀干左右腹側(cè)，自腋至腹股溝部各出現(xiàn)一條凸向中線的曲線，稱為乳線（亦稱乳紋或乳帶）。人類乳帶在胸壁產(chǎn)生一對乳嵴；在鼠類，乳帶產(chǎn)生五對乳嵴。在人類和鼠類，乳嵴處的外胚層增厚，形成基板。繼之，該部上皮發(fā)育為侵入間葉組織（小鼠為脂肪墊，人類為纖維間質(zhì)）的原基上皮芽。人類乳腺始基大部分上皮細(xì)胞呈CK19與CK14雙陽性，而小鼠乳腺者僅呈CK14陽性。原基上皮芽發(fā)育成管狀導(dǎo)管，延伸并分支，終止于上皮增生活躍的杵狀球形結(jié)構(gòu)，即終端芽（TEB）。 TEB由多層體細(xì)胞（body cell）外覆單層帽細(xì)胞 （cap cell）構(gòu)成。帽細(xì)胞是具旺盛細(xì)胞分裂及向腔上皮與肌上皮分化能力的細(xì)胞。體細(xì)胞為腔上皮的前身。小鼠10～12周齡時，乳腺導(dǎo)管樹長至脂肪墊邊緣后，TEB退化。人類青春期乳腺在全身性激素影響下，進一步發(fā)育，導(dǎo)管樹繼續(xù)延伸與分支，形成具有終末導(dǎo)管小葉單位（TDLU）或稱乳腺功能單位的分支導(dǎo)管系統(tǒng)。在小鼠其乳腺小葉結(jié)構(gòu)則至妊娠期才開始形成。

TDLU是由埋于小葉間質(zhì)中的短距終端導(dǎo)管及由它生出的小導(dǎo)管構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。Russo J 和Russo I H將人類乳腺小葉分為四型（Lob1, 2, 3, 4）。I 型小葉（Lob1）即所謂處女型乳腺小葉，其終端導(dǎo)管分出4～11個小導(dǎo)管。月經(jīng)來潮后1～2年， Lob1發(fā)育成 II型小葉（Lob2），每個腺小葉的小導(dǎo)管數(shù)平均為47個。妊娠期，人類乳腺發(fā)生比較急劇的改變，Lob2演進為Lob3，每小葉的小導(dǎo)管數(shù)平均為81個。隨著妊娠的進展，Lob3又日益轉(zhuǎn)變?yōu)長ob4，每個腺泡的上皮分裂活躍且胞質(zhì)增多。妊娠后期時，腺泡分泌活性日益增強，腺腔擴張，內(nèi)含分泌物。哺乳時，乳腺腺體很少增生活動。隨著乳房規(guī)律性地排乳，乳汁繼續(xù)被合成并釋入乳腺腺泡與導(dǎo)管系統(tǒng)。乳汁在導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)貯積若超過48 h，則導(dǎo)致乳汁的合成與分泌減少。

哺乳停止后，乳腺開始復(fù)舊。90%的腺上皮凋亡。退變的腺體成分被脂肪細(xì)胞取代。復(fù)舊的人類乳腺發(fā)生顯著的形態(tài)學(xué)改變，至乳腺的形態(tài)如妊娠前的狀態(tài)。但是，復(fù)舊的小鼠乳腺像處女小鼠的一樣，仍保留著一些腺泡。

每一次妊娠都重復(fù)著自Lob2至Lob4而后復(fù)舊的改變。乳腺的再生有賴于乳腺干細(xì)胞的存在及其在諸多激素與信號調(diào)控下的對稱性與不對稱性的細(xì)胞分裂能力。正常乳腺干細(xì)胞在胚胎/胎兒發(fā)育過程、青春期和妊娠期特別具有增生活性，這也涉及動情周期腺體的有限性擴增[1～3]。

2 乳腺干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

上世紀(jì)50～80年代，幾組研究者（DeOme等1959， Daniel和Deome 1965，Deniel和Young 1971，Smith 和Medina 1988）先后進行乳腺再生的實驗研究。實驗分離小鼠乳腺上皮，進行有限稀釋培養(yǎng)，獲得細(xì)胞克隆，將其移植入已清除腺管系統(tǒng)的受體小鼠乳房脂肪墊。結(jié)果，再生出由腔上皮與肌上皮組成的導(dǎo)管腺泡枝條。他們發(fā)現(xiàn)，在小鼠乳腺發(fā)育的整個過程，自其任何一部分取樣培養(yǎng)移植，均可分離出具有完全再生能力的細(xì)胞。Kordon和Smith （1998）進一步證明，自小鼠乳腺分離出以逆病毒標(biāo)記的單個細(xì)胞克隆，移植后，可再生成完整的乳腺腺體。據(jù)評估，這些克隆化的干/祖細(xì)胞占乳腺上皮細(xì)胞的1/1000～2000。

Chepko和Smith（1997）在電鏡下分析鼠類乳腺超微結(jié)構(gòu)，觀察到五種類型細(xì)胞，包括原始小亮細(xì)胞（SLC)、未分化大亮細(xì)胞（ULLC）、分化良好大亮細(xì)胞（DLLC）與大暗細(xì)胞（LDC）及典型分化細(xì)胞（腔上皮細(xì)胞與肌上皮細(xì)胞）。其中，小亮細(xì)胞約占上皮細(xì)胞的3%，它不與管腔接觸、無極向、形如阿米巴、核小、細(xì)胞器少。并可見由SLC向ULLC與肌上皮分化的過渡型細(xì)胞。研究者們設(shè)想，小亮細(xì)胞包括干細(xì)胞和I級祖細(xì)胞。

正常乳腺干細(xì)胞可處于不分裂的靜息狀態(tài)。將標(biāo)記的DNA前體，如氚化胸腺嘧啶核苷或溴脫氧脲核苷作為標(biāo)記物，注入小鼠后，標(biāo)記物可長期保存于干細(xì)胞內(nèi)。多個研究組利用這個手段來發(fā)現(xiàn)乳腺干細(xì)胞。例如，Smith（2005）用 [3H]-胸腺嘧啶（3HTdR）標(biāo)記小鼠的移植乳腺組織。追蹤3～4周后，第二次注射BrdU標(biāo)記，在乳腺組織中可見到很大比例的3HTdR細(xì)胞結(jié)合了BrdU。追蹤觀察，子代細(xì)胞中BrdU標(biāo)記減少，而3HTdR則繼續(xù)保存。

人類正常乳腺新生上皮源于共同細(xì)胞的最初證據(jù)來自對X-染色體滅活型的分析。胚胎發(fā)育的種植前階段，胚細(xì)胞發(fā)生隨機性父方或母方X染色體滅活，從而給其后代細(xì)胞留下永久性標(biāo)記。因此，通過分析X聯(lián)系基因多態(tài)性DNA標(biāo)記的甲基化狀態(tài)，可評估組織的克隆形成能力。Tsui等分析DNA甲基化狀態(tài)類型，證實人類乳腺整個小葉和大導(dǎo)管中，均散在有具相同X染色體滅活細(xì)胞組成的區(qū)域。

Clarke等把[3H]標(biāo)記的人類乳腺上皮細(xì)胞移植于無胸腺裸鼠，發(fā)現(xiàn)兩周后有7～9%的細(xì)胞保留[3H]標(biāo)記。這些細(xì)胞表達所設(shè)想的干細(xì)胞標(biāo)志p21CIP/ WAF和Husashi-1（RNA結(jié)合蛋白）。

利用活體移植證實，人類乳腺干細(xì)胞的存在需要克服異體移植障礙。Kuperwasser等利用免疫受損小鼠建立活體正位異種移植模型。他們把取自人類乳腺的纖維母細(xì)胞與乳腺上皮細(xì)胞植入受體裸小鼠，觀察到在人類化的間質(zhì)中，人乳腺細(xì)胞新生成了形態(tài)與分化均呈正常情況的乳腺[1～4]。

3 識別乳腺干細(xì)胞常用的方法

3.1 細(xì)胞表面標(biāo)記：包括細(xì)胞角蛋白、整合素與黏附因子成員、干細(xì)胞抗原-1等。

（1） CK：乳腺分化性腔上皮表達CK8/18/19，肌上皮表達CK14與SMA?；钴S增生的上皮細(xì)胞表達CK6。B?cker等發(fā)現(xiàn)尚有一種表達CK5，而CK8/18/19與SMA均呈陰性的細(xì)胞，它可經(jīng)過CK5/8/18/19或CK5/SMA陽性的中間階段演變?yōu)榍簧掀ぜ?xì)胞或肌上皮細(xì)胞。

（2） 整合素成員CD49f與CD29，黏附因子成員CD44與CD24：從小鼠乳腺分離純化的CD49fhighCD24medLin–或CD29highCD24+Lin–細(xì)胞系，位于腺管的基底層。將其單細(xì)胞移植，可形成完全的乳腺組織。CD44+CD24-/lowLin–也具有同樣自我更新與雙向分化能力。提示，這類細(xì)胞亞群具干細(xì)胞性質(zhì)。

（3） Sca-1（干細(xì)胞抗原-1，Ly-6a）：這是一種磷脂酰肌醇—錨定膜蛋白。在小鼠骨髓與肌的干細(xì)胞表達。將經(jīng)熒光激活細(xì)胞分選（FASC）法分離的Sca-GFP+細(xì)胞，或經(jīng)磁珠分選法分離的小鼠乳腺Sca+細(xì)胞植入已清除腺組織的小鼠乳房脂肪墊后，可產(chǎn)生乳腺支條。提示該Sca+細(xì)胞亞群中含有干細(xì)胞。但是，Shackleton等和Stingl等報道，高度純化的乳腺干細(xì)胞呈Sca-1低表達，而且，在人類基因中未發(fā)現(xiàn)Ly-6a同源物。

3.2 乙酰脫氫酶（ALDH）

ALDH超家族包括19種同功酶，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可使乙酰脫氫氧化成乙酸，從而保護細(xì)胞以避免醛過氧化物的損害。認(rèn)為ALDH高表達是一群具干/祖細(xì)胞性質(zhì)細(xì)胞的特征。從人類乳房縮減手術(shù)所取得的乳腺樣品中分離的ALDHbr細(xì)胞與未分類細(xì)胞比較，前者乳腺球的形成率高20倍。將ALDHbr細(xì)胞移植于乳腺脂墊后，形成未定型肌上皮、腔上皮和二者混合的集落及導(dǎo)管；而ALDHdim細(xì)胞群僅形成腔上皮細(xì)胞。認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)ALDH高活性是干細(xì)胞的特征之一。ALDHbr細(xì)胞群已從人類的血液、骨髓、肌肉與乳腺，及嚙齒類的腦、胰與前列腺揀選出來。

3.3 Sp分析

細(xì)胞膜具有多藥轉(zhuǎn)運泵。Bcrp的細(xì)胞可以排出外來有毒物質(zhì)。體外培養(yǎng)的乳腺干細(xì)胞表達Bcrp，它能排除加入培養(yǎng)基中的細(xì)胞毒性Hoechst3342，而得以存活。這種存活的細(xì)胞與其它被毒殺的細(xì)胞呈不同的熒光著色，因而可加以識別。排除Hoechst3342的細(xì)胞稱之為Sp（side population）細(xì)胞，據(jù)稱，它們占乳腺上皮干細(xì)胞的1/5～1/10。

3.4 體外培養(yǎng)乳腺球

Dontu等應(yīng)用類似Reynolds和Weis體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞球的方法，自乳房復(fù)原成形術(shù)切除的乳腺組織中分離人類乳腺上皮細(xì)胞，將其置于含EGF和（或）bFGF的無血清培養(yǎng)基中，在非黏著性底物上培養(yǎng)，所培養(yǎng)的細(xì)胞中絕大多數(shù)發(fā)生失巢凋亡（anoikis）。但在每1000個分離出的細(xì)胞中約有4個細(xì)胞能生存并繁殖形成多細(xì)胞球—乳腺球，它們是富含CD49f+，CK5+和CD10的未分化細(xì)胞，也有很少數(shù)表達腔上皮標(biāo)記CK14的細(xì)胞。所培養(yǎng)的未分化細(xì)胞經(jīng)多次傳代仍保持原來的未分化狀態(tài)。而在培養(yǎng)基中加入促分化的膠原底物后，形成表達導(dǎo)管上皮與肌上皮的集落。在重建3-D培養(yǎng)系統(tǒng)的matrigel，乳腺球所含細(xì)胞能克隆出與導(dǎo)管和腺泡相似的分支結(jié)構(gòu)。Dontu等用FACS從未經(jīng)體外培養(yǎng)的乳腺上皮中分離出Sp與非Sp細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其中僅Sp組分能形成乳腺球，并產(chǎn)生多譜系細(xì)胞集落及在NOD/SC2D小鼠乳房脂肪墊形成乳腺上皮支條。這類支條具有人類乳腺導(dǎo)管腺泡結(jié)構(gòu)及其組成細(xì)胞成分的特征[1,2,4,5]。

4 乳腺干/祖細(xì)胞級別分化系統(tǒng)

Gudjonsson等[7]應(yīng)用流式細(xì)胞計和HPV E6E7永生化技術(shù)，從人類乳腺分離出分別表達干細(xì)胞標(biāo)記MUC1–/ESA+(E6/E7)和系限制性標(biāo)記MUC1+/ESA+(E6/E7)的兩個細(xì)胞系，前者為永生化克隆性，產(chǎn)生具親代原有特性及呈腔上皮與肌上皮表型后代，并在3D1rECM上形成終末導(dǎo)管小葉單位樣結(jié)構(gòu)。后者則在3D1rECM上只形成腺泡樣結(jié)構(gòu)。Villadsen等[8]利用體外非粘著性乳腺球形成,細(xì)胞譜系HPVE6/E7轉(zhuǎn)導(dǎo),熒光激活細(xì)胞揀選（FACS）分析和克隆化，結(jié)合免疫化學(xué)、RT-PCR和RS-PCR等技術(shù)，從人類乳腺分離得4個細(xì)胞系，其中表達干細(xì)胞標(biāo)記SSEA4hi/CK5/ CK6a+/CK15+/Bcl+的細(xì)胞與位于乳腺導(dǎo)管干細(xì)胞帶的CK19+/CK14+/CD49f+Lin–EPCAM+細(xì)胞屬同類，具克隆性生長與自我更新能力。其它3個為分別呈腔上皮祖細(xì)胞與肌上皮祖細(xì)胞分化傾向的細(xì)胞系，位于干細(xì)胞鄰近的遠側(cè)。

Stingl等[9]把小鼠乳腺上皮移植所生成的乳腺結(jié)構(gòu)再分離，進行單細(xì)胞浮懸培養(yǎng)，檢出由單個細(xì)胞增生所成組織學(xué)似正常乳腺的再繁殖單位（MRUs）生長物，其中含有CD49fhiCD24med細(xì)胞。高純化的單個MRU可進行至少10代對稱性細(xì)胞分裂。其子代細(xì)胞有呈CD49flowCD24hi標(biāo)記的Ma-CFCs。Shackleton等[10]將自小鼠乳腺分離出的Lin–細(xì)胞系加以移植，按CD24和CD29表達情況分為4個亞群，其中Lin–CD29hiCD24+表達可使MRU增長8倍，連續(xù)三輪傳代，保持原有特性。其它三個亞群則無此能力。將Rosa-26小鼠的Lin-CD24+CD29hi細(xì)胞浮懸液以每個注射量含一個細(xì)胞的濃度進行102次移植，有六次產(chǎn)生由腔上皮與肌上皮構(gòu)成的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)。受體小鼠妊娠時，單細(xì)胞繁殖形成的腺泡導(dǎo)管內(nèi)出現(xiàn)乳汁蛋白與脂滴，說明移植物充分分化。

Stingl等[11]從人乳腺分離單個細(xì)胞，將其在集落形成條件下浮懸培養(yǎng)，獲得三類集落，包括腔限制性祖細(xì)胞、肌上皮祖細(xì)胞及具腔上皮與肌上皮雙向功能祖細(xì)胞。據(jù)此，Stingl等設(shè)想，乳腺干細(xì)胞后代的級別分化，首先是雙能祖細(xì)胞，繼之，由雙能祖細(xì)胞產(chǎn)生腔限制性與肌限制性細(xì)胞。

Van Keymeulen等[12]對發(fā)育中、成年與妊娠中小鼠進行譜系追蹤和克隆分析，發(fā)現(xiàn)出生后未曾受干擾乳腺的腔上皮和肌上皮細(xì)胞譜系分別含長壽單能干細(xì)胞。這兩類單能干細(xì)胞在乳腺形態(tài)發(fā)生期、成年與妊娠周期均顯示大量克隆性擴增能力。Van Keymeulen等因而認(rèn)為小鼠乳腺最初從多能性K14+前體細(xì)胞起始發(fā)育。這種前體細(xì)胞生成肌上皮與腔上皮。在青春期與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定時，肌上皮與腔上皮譜系的維持分別是靠能向肌上皮分化的肌上皮限制性與向腔上皮分化的腔上皮限制性干/祖細(xì)胞來保證的。

5 妊娠誘發(fā)乳腺上皮細(xì)胞亞型（PI-MEC）

未經(jīng)產(chǎn)婦與經(jīng)產(chǎn)婦發(fā)生乳腺癌的危險性存在差別，與妊娠所致乳腺上皮基因表達狀態(tài)永久性改變相關(guān)。Ginger等比較經(jīng)激素處理和未經(jīng)激素處理的Wister-Furth大鼠乳腺，用減數(shù)雜交法鑒定二者基因表達的差別。于最末一次處理后28天，可識別100個呈不同表達的基因位點。D'Cruz用寡核苷酸陣列，比較經(jīng)產(chǎn)小鼠與未經(jīng)產(chǎn)小鼠乳腺上皮，觀察到眾多基因的表達譜差異。Boulanger應(yīng)用Cre-lox技術(shù)，觀察到在非哺乳未妊娠經(jīng)產(chǎn)小鼠乳腺上皮富含一種上皮亞型。這種由經(jīng)產(chǎn)誘發(fā)的乳腺上皮細(xì)胞（PI-MECs）永久性地定居于經(jīng)哺乳改造的導(dǎo)管終端（即小葉腺泡單位）。PI-MECs具自我更新與多能性。把含有標(biāo)記PIMECs的乳腺碎片植入未經(jīng)產(chǎn)宿主已清除腺管的乳房脂肪墊，PI-MECs非常顯著地使小導(dǎo)管延長。在75%以上的移植物中，自PI-MEC來源的細(xì)胞存在于整個腺體導(dǎo)管樹。WAP-TGF-β1表達可中斷PI-MECs在移植物中的自我更新[13]。

6 乳腺干細(xì)胞龕

調(diào)控干細(xì)胞的局部微環(huán)境稱之為niches（壁龕或龕）。Chepko稱，龕由信號細(xì)胞、特征性細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、可溶性介質(zhì)和干細(xì)胞組成。乳腺干細(xì)胞及其龕的部位目前尚未完全確定。有證據(jù)表明，小鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育時，其終端芽（TEBs）帽區(qū)可能是干細(xì)胞龕的所在之處。但當(dāng)導(dǎo)管樹發(fā)育完全后，TEBs和帽細(xì)胞不再存在?？梢姡私Y(jié)構(gòu)并非成年乳腺干細(xì)胞龕的所在之處。Sonnenberg等發(fā)現(xiàn)小鼠乳腺導(dǎo)管（而非腺泡）的細(xì)胞可再生導(dǎo)管與腺泡芽，因此設(shè)想導(dǎo)管的這類細(xì)胞為干細(xì)胞。從小鼠任一部位取組織移植均可產(chǎn)生完整結(jié)構(gòu)—能泌乳的乳腺。這一事實說明乳腺干細(xì)胞龕以規(guī)則地間距分布于整個乳腺。Villadsen等從乳腺縮減成形術(shù)的乳腺中收集樣品進行顯微切割。證實終末導(dǎo)管是成年人類乳腺干細(xì)胞的主要部位之一。從這些部位分離的細(xì)胞具SSEA-4、CD49f、CK^等干細(xì)胞標(biāo)記表達，經(jīng)體外無血清非粘著性培養(yǎng)產(chǎn)生自我更新乳腺球，2D培養(yǎng)產(chǎn)生多譜系集落，3D ECM培養(yǎng)產(chǎn)生TDLU樣結(jié)構(gòu)。

Danial和Deome等所作移植實驗證明小鼠乳房脂肪墊與人類纖維母細(xì)胞分別是小鼠和人類含乳腺干細(xì)胞移植物生長的必要條件。提示，間質(zhì)是乳腺干細(xì)胞龕的組成成分。

Boulanger等[14]把成年小鼠睪丸輸精小管內(nèi)具遺傳標(biāo)記的生精細(xì)胞與乳腺上皮單細(xì)胞懸液混合后，注入清除腺體的乳房脂肪墊，發(fā)現(xiàn)重新程序化的睪丸細(xì)胞生成乳腺結(jié)構(gòu)。Nishimura等及Collin等發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞被實驗性清除后，其子代定向祖細(xì)胞可遷入空龕定居，并獲得干細(xì)胞功能。這類實驗表明，干細(xì)胞的干性是由龕所決定的。

乳腺干細(xì)胞為ERα陰性。它的增生需要龕內(nèi)ERα陽性細(xì)胞（“感覺細(xì)胞”）的旁分泌刺激。青春期小鼠乳腺導(dǎo)管呈指數(shù)擴增，此時雌激素誘導(dǎo)“感覺細(xì)胞”合成分泌amphiregulin （EGF家族成員）。Amphiregulin被激活后，作用于EGFR陽性的間葉細(xì)胞，可能是這些細(xì)胞釋出增生信號，或TGFβ抑制物，解除TGFβ對乳腺增生的抑制作用。增生信號或增生抑制解除，從而激發(fā)龕內(nèi)干細(xì)胞分裂活動，使導(dǎo)管延長。

孕酮在性成熟后取代雌激素，也以旁分泌方式來刺激受體陽性和陰性的乳腺腔上皮增生，形成乳腺小導(dǎo)管側(cè)支與腺泡。介導(dǎo)孕酮旁分泌效應(yīng)的是 RANKL和Wnt4。RANKL由腔系細(xì)胞分泌，其受體RANK由干細(xì)胞群表達（Asselin-Labet等2010）。這意味著腔上皮細(xì)胞是干細(xì)胞龕的成分。Wnt4信號被認(rèn)為是直接作用于龕內(nèi)干細(xì)胞，激發(fā)其不對稱核分裂，從而控制干細(xì)胞自身的繁殖。

綜上所述，小鼠乳腺干細(xì)胞在青春期是由雌激素調(diào)控，而妊娠期則由孕酮調(diào)控。

Wnt信號喪失伴有乳腺發(fā)育缺陷。應(yīng)用Wnt活性報告者小鼠證實，乳腺管道系統(tǒng)幾乎所有分支呈Wnt陽性染色反應(yīng)，尤為重要的是，Wnt活性是從導(dǎo)管基底層，即乳腺干細(xì)胞龕所在處檢出的。應(yīng)用基因組轉(zhuǎn)錄子分析顯示TEB富含Wnt-2、4、5a、5b、6和7b。小鼠成熟期乳腺導(dǎo)管僅富于Wnt-4、5b和6。 Wnt-2、5a和7b在處女期小鼠乳腺強表達，妊娠期下調(diào)。反之，妊娠期誘發(fā)Wnt-4、5b和6表達。

Hedgehog信號介導(dǎo)乳腺發(fā)育過程中上皮—間質(zhì)相互作用，影響細(xì)胞增生、分化與器官形成模式。每一器官結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育均需Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的適當(dāng)調(diào)控，但并非任何情況下都需Hh激活。Ihh和Dhh在青春期乳腺表達，妊娠/哺乳期僅Ihh上調(diào)；敲除實驗提示，對于乳腺形成hh并非不可缺少。單一Ptch-1（Hh受體）不足，可引起導(dǎo)管增生與結(jié)構(gòu)不良。發(fā)育各期的乳腺上皮均有Gli2和Gli3表達。Gli2裸鼠乳腺組織產(chǎn)生不正常分支與擴張狀態(tài)的導(dǎo)管。

Notch信號促進乳腺干/祖細(xì)胞自我更新。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活躍可使體外培養(yǎng)乳腺球形成率與雙能CFC生成率提高，及三維matrigel培養(yǎng)支條形態(tài)發(fā)生增強。反之，用阻抑Notch信號的抗體可完全消除繼發(fā)性乳腺球形成。Notch-1和-3在正常乳腺的腔細(xì)胞表達。在腔限制性集落形成細(xì)胞，Notch-3表達增強。抑制Notch-3足以阻止體外雙能性集落細(xì)胞生成腔上皮。Notch-4在基底層和肌上皮區(qū)間，即乳腺干細(xì)胞所在處表達。Notch-4的結(jié)構(gòu)性活化形式過表達，在體外，可抑制正常乳腺上皮分化。在活體，使轉(zhuǎn)基因小鼠正常乳腺分支形態(tài)與腺泡結(jié)構(gòu)不能形成。

TGFβ在調(diào)節(jié)乳腺干細(xì)胞動力學(xué)、維持其未分化狀態(tài)和建立特有的乳腺結(jié)構(gòu)方面具關(guān)鍵性作用。在體內(nèi)、體外，TGFβ是乳腺上皮增生強有力的抑制劑，而對間葉源細(xì)胞則有明顯激活作用。TGF-β3存在于終末芽帽細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)。TGFβ1則存在于非生長期導(dǎo)管周圍基質(zhì)內(nèi)。TGFβ在乳腺導(dǎo)管樹建立后能抑制側(cè)支芽發(fā)生[2,5,15,16]。

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Identification, regeneration, differentiation and regulation of breast stem cell

ZHANG Zhong★, LI Lianhong, XIE Fengpei
(Department of Pathology, Dalian Medical University, Liaoning, Dalian 116044, China)

The development and regeneration of the breast depend upon the proliferation of the breast stem cell (BSC). BSCs with their niches are in the cap areas of the terminal end buds (TEBs) in the primordial duct system of the breast rudimentum in embryos, and distributed with regular interval in the duct system, mainly in the terminal duct areas of the adult breast. The BSCs may be identified by using phenotypic markers, Sp analysis and mammosphere formation in vitro. The hierarchy-differentiation of the progeny of BSC is firstly bipotential progenitors, then, lumen-restricted and myo-restricted cells. Pregnancy can induce PI-MEC with selfrenewal and multipotential ability. The BSCs in puberty and pregnancy are controlled separately by estrogen and progesterone. The self-renewal and differentiation ability of the stem cells or the progenitors of the breast epithelium are controlled by some factors of several signal transduction systems, such as Wnt, Hedgehog, Notch and TGF-beta etc.

Breast stem cell; Regeneration; Differentiation; Signal control

大連醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，遼寧，大連 116044

★通訊作者：張眾，E-mail:kcz_zhang@yahoo.com.cn