余曉軍 藍小春

維生素D受體基因BsmI位點多態(tài)性與橋本甲狀腺炎的關(guān)系

余曉軍 藍小春

隨著人們對維生素D認識的不斷加深，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)維生素D不但參與鈣磷代謝的調(diào)節(jié)，而且參與細胞免疫的調(diào)節(jié)。研究已證實活性維生素D[1，25（OH）2D3]與眾多的自身免疫性疾病發(fā)病相關(guān)，其可以阻止實驗性橋本甲狀腺炎（HT）等自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生[1]，其生物學(xué)作用是通過維生素D受體蛋白（VDR）所介導(dǎo)的。本研究將VDR基因作為候選基因，探討VDR基因BsmI位點多態(tài)性與HT的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2009-11—2011-11在蘭溪市人民醫(yī)院內(nèi)分泌門診就診的初發(fā)HT患者75例（HT組），其中男20例，女55例，年齡20～47（36.31±14.25）歲。根據(jù)臨床癥狀、體征、甲狀腺功能（FT3、FT4、TT3、TT4、TSH）測定結(jié)果、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）和甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）強陽性以及甲狀腺細針穿刺活檢結(jié)果（涂片可見較多淋巴細胞或有濾泡細胞嗜酸變者）等確診，排除其他原因引起的甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退以及合并其他自身免疫性疾病的患者。另選擇健康體檢者80例為對照組（CN組），其中男30例，女60例，年齡26～50（39.15±4.21）歲，均為同時期無血緣關(guān)系的健康體檢者，無甲狀腺疾病及其他自身免疫性疾病的臨床表現(xiàn)、相關(guān)既往史及家族史。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取枸櫞酸二鈉（EDTA）抗凝血50μl，用堿裂解法提取外周血白細胞DNA。

1.2.2 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）：反應(yīng)引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列：上游5′GGG AGA CGT AGC AAA AGG 3′；下游5′AGA GGT CAA GGG TCA CTG 3′。PCR反應(yīng)體系（25μl）：10×PCR緩沖液2.5μl，MgCl22.5μl，dNTP（10mM）0.5μl，上下游引物（10μM）各1.25μl，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA3μl，純水13.9μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94°C 3min，變性94°C 40s，退火62°C 50s，延伸72°C 60s，共30個循環(huán)，最后終末延伸72°C 5min。擴增產(chǎn)物為359bp，于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP） PCR產(chǎn)物經(jīng)BsmI限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，置于2%的瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。BB型為不含BsmI酶切位點，即酶切后只有一個359bp的片段；bb型為兩條染色體均有酶切位點，酶切后有兩個片段，即169bp、190bp；Bb型為雜合型只有一條染色體含酶切位點，酶切后有3個片段，即359bp、169bp、190bp。所有試劑均購自上海生物工程技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，各組間基因型、等位基因頻率分布采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

兩組VDR-BsmI基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，證實本實驗樣本具有群體代表性。VDRBsmI基因型、等位基因分布頻率的比較 見表1。

表1 VDR-BsmI基因型、等位基因分布頻率比較[例（%）]

由表1可見，HT組與CN組間的VDR-BsmI基因型、等位基因分布頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 1.685、2.189，均P＞0.05）。

3 討論

HT是一種器官特異性的自身免疫疾病，其發(fā)生、發(fā)展是遺傳、免疫及環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。研究認為免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)失衡（Th1/Th2平衡偏移）是HT發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：Th1/Th2平衡遭到破壞，Th1型細胞因子（IL-2、IFN一γ、IL-12、TNF-α和TNF-β）的分泌占主導(dǎo)地位，這類細胞因子可通過改變免疫活性細胞的某些功能狀態(tài)直接或間接參與HT的發(fā)生[2-3]。同時這些細胞因子的基因多態(tài)性也與HT的發(fā)生密切相關(guān)[4]。

1，25（OH）2D3是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，尤其針對T細胞介導(dǎo)的細胞免疫。其主要作用靶細胞是Th1細胞，它可通過直接抑制Th1細胞從而達到下調(diào)Th1、上調(diào)Th2細胞的作用。調(diào)節(jié)Th1/Th2比例失衡引發(fā)的免疫紊亂[5]。其生物學(xué)功能主要通過VDR介導(dǎo)。VDR基因位于常染色體12q13-14,其基因組DNA全長45kd，由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成,存在多個多態(tài)性位點最常見的為：3'端的BsmI、ApaI、TaqI和5′端的FokI。這些區(qū)域的堿基的變化都會影響VDR基因的轉(zhuǎn)錄及VDR蛋白合成與活性，從而影響1，25（OH）2D3發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用引致自身免疫性疾病的發(fā)生[6]。

目前關(guān)于VDR基因與HT相關(guān)性的研究鮮有報道，臺灣地區(qū)的一項研究認為VDR基因多態(tài)性與HT的發(fā)病相關(guān),HT患者與正常人群間VDR的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分布的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0458）；且VDRFokI基因是HT發(fā)病的易感因素[7]。本研究通過檢測HT患者以及健康人群的VDR基因BsmI位點后發(fā)現(xiàn)兩組間VDR-BsmI基因型及等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此認為VDR基因BsmI位點多態(tài)性與HT發(fā)病無關(guān)，VDR-BsmI基因型不能作為預(yù)測發(fā)生HT的遺傳標志。

總之，VDR基因不僅存在種族、地區(qū)的差異性，同時還存在多個多態(tài)性位點，不同位點的多態(tài)性以及與臨近位點的基因協(xié)調(diào)作用也可能會影響HT的發(fā)生。因此對于VDR基因其他位點多態(tài)性是否與HT發(fā)病相關(guān)還有待于進一步研究證實。

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[5]Meehan T F,DeLuca H F．The vitamin D receptor is necessary for 1alpha,25-dihydroxyvitamin D (3)to suppress experimental autoimmune encephalomyelitis in mice[J]．Arch Biochem Biophys, 2002,408(2):200-220．

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2012-12-20）

（本文編輯：楊麗）

321100 蘭溪市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所（余曉軍），蘭溪市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（藍小春）