封菲 王曉楠 章順榮 丁美萍 高越

神經(jīng)激肽1受體拮抗劑對大鼠腦缺血再灌注的神經(jīng)保護(hù)作用

封菲 王曉楠 章順榮 丁美萍 高越

目的 觀察大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)激肽1受體拮抗劑對腦梗死體積、腦組織含水量及神經(jīng)行為學(xué)變化的影響，探討減輕神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)對腦缺血再灌注的保護(hù)作用。 方法 將54只大鼠分為藥物組、假手術(shù)組、對照組，用線栓法建立右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注大鼠模型，藥物組和對照組大鼠在再灌注時經(jīng)尾靜脈分別注入神經(jīng)激肽1受體拮抗劑及生理鹽水，假手術(shù)組只分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈。缺血再灌注后24h時采用免疫組化法檢測P物質(zhì)表達(dá)，氯化三苯基四氮唑染色法測定腦梗死體積，干-濕稱重法檢測腦組織含水量；分別于再灌注24h及72h時利用轉(zhuǎn)棒試驗和肢體不對稱試驗檢測神經(jīng)行為學(xué)變化。 結(jié)果腦缺血再灌注后24h大鼠腦缺血區(qū)P物質(zhì)的表達(dá)明顯升高，腦組織含水量明顯增加。藥物組與對照組比較，腦組織含水量減少，神經(jīng)功能改善。 結(jié)論 神經(jīng)激肽1受體拮抗劑可通過抑制神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)而達(dá)到缺血再灌注損傷時的腦保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】缺血再灌注 P物質(zhì) 腦水腫 神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)

缺血性腦卒中患者的預(yù)后與腦水腫是否形成密切相關(guān)，現(xiàn)已證實外周組織水腫形成與神經(jīng)肽物質(zhì)釋放引起血管通透性增加密切相關(guān)[1]，這一炎癥過程稱之為神經(jīng)源性炎癥，其主要特點為血管擴(kuò)張和血漿蛋白外滲[2]。在神經(jīng)肽物質(zhì)中目前認(rèn)為P物質(zhì)（substance P，SP）是神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的始動因素并起到最關(guān)鍵的作用[3]。SP受體中神經(jīng)激肽1受體具有更高的親和性，關(guān)于在急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害時應(yīng)用神經(jīng)激肽1受體拮抗劑的研究很少。本研究擬通過檢測大鼠腦缺血再灌注后缺血半暗帶神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)相關(guān)免疫指標(biāo)SP的表達(dá)變化、腦水腫程度、腦梗死體積及神經(jīng)功能的改變，探索神經(jīng)激肽1受體拮抗劑在缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備及處理 成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠54只（體重250～300g，清潔度Ⅱ級，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供），隨機(jī)分為藥物組、假手術(shù)組及對照組3組，每組18只。每組再分為3亞組（每亞組6只），分別用于檢測大鼠腦缺血再灌注24h腦組織SP的表達(dá)及腦梗死體積、再灌注24h神經(jīng)行為學(xué)評估及腦組織含水量和再灌注72h神經(jīng)行為學(xué)評估。用10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，按照Bederson等的方法制作線栓法大鼠腦缺血再灌注模型，手術(shù)前后大鼠肛溫維持（37.0±0.5）℃。缺血90min后抽提栓線至頸外動脈殘端內(nèi)進(jìn)行再灌注。藥物組大鼠于再灌注時立即尾靜脈給予神經(jīng)激肽1受體拮抗劑N-乙酰-L-半月光氨酸（25μmol/kg）[4]。假手術(shù)組大鼠手術(shù)時只分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動脈，不插入栓線，并于再灌注時予1ml 0.9%氯化鈉注射液。

1.2 試劑和儀器 神經(jīng)激肽1受體拮抗劑（國準(zhǔn)字號H20053574）購自天津天安藥業(yè)股份有限公司，兔抗鼠SP多克隆抗體購自美國Sigma公司，SP免疫組化試劑盒及DAB顯色系統(tǒng)購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，氯化三苯基四氮唑購自中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司，Olympus-CH2顯微鏡購自日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社，Rotarod儀由香港中文大學(xué)器械服務(wù)公司提供。

1.3 免疫組化技術(shù)檢測SP的分布 大鼠腦缺血再灌注24h時取腦連續(xù)冠狀切片得第4腦片（厚2.0mm），常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、用切片機(jī)連續(xù)5μm厚冠狀切片。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、煮沸法修復(fù)，過氧化氫阻斷，滴加一抗（工作濃度1∶1 000），根據(jù)免疫組化試劑盒說明書對切片標(biāo)本進(jìn)行操作，予DAB顯色，自來水沖洗后蘇木素復(fù)染，脫水、封片，表達(dá)SP處在光鏡下為棕黃色物質(zhì)。

1.4 腦梗死體積測定 各組大鼠于再灌注24h用200ml0.9%氯化鈉注射液經(jīng)心臟灌流后快速斷頭取腦，去除嗅球和腦干，連續(xù)冠狀切片（厚2.0mm）。取第4腦片轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存用于免疫組化，其余腦片放入0.5%的氯化三苯基四氮唑溶液，37℃孵育箱中孵育30min后，多聚甲醛固定24h。攝片后采用Medbrain 2.0處理系統(tǒng)（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)實驗室提供），計算每一腦片正常側(cè)及缺血側(cè)腦半球紅染（未缺血）的面積，兩者相減得到矯正后的缺血面積。面積乘以厚度，并迭加每片數(shù)據(jù)后得到腦梗死灶體積百分比，采用單盲法。

1.5 腦組織含水量測定 利用干濕稱重法。大鼠快速斷頭取腦，取右側(cè)大腦半球用電子天平獲取濕重，置入100℃恒溫干燥箱內(nèi)48h再獲取干重，腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.6 神經(jīng)行為學(xué)評估

1.6.1 轉(zhuǎn)棒試驗 將各組大鼠于時間觀察點放于Rotarod儀上，Rotarod的轉(zhuǎn)速在5min之內(nèi)勻速增加到40r/ min，若大鼠從Rotarod儀上落下，或緊抓于Rotarod上連續(xù)2圈不作運動則實驗結(jié)束，記錄大鼠在Rotarod上運動的時間，一旦大鼠從Rotarod儀上落下，下面的電刺激器將給大鼠電刺激促使大鼠盡最大能力在Rotarod儀上運動。手術(shù)前3d開始訓(xùn)練大鼠，手術(shù)前1 d對每只大鼠進(jìn)行3次測試，取最長持續(xù)時間為基線。觀察點對每只大鼠進(jìn)行3次測試，取其最長持續(xù)時間與正?；€值的百分比作為反映大鼠運動功能的指標(biāo)。

1.6.2 肢體不對稱試驗 正常大鼠在玻璃圓桶中會不時站立，用雙側(cè)前肢交替或同時觸及桶壁，應(yīng)用雙側(cè)前肢的頻率應(yīng)該相等，有缺血性腦損傷的大鼠偏癱側(cè)肢體應(yīng)用較少。觀察并記錄雙側(cè)前肢的應(yīng)用情況，對每只大鼠每次記錄20次活動，以肢體應(yīng)用的百分率計算最后得分，得分=（R-L）/（R+L+B）×100%[R：右側(cè)前肢（健側(cè)）獨立應(yīng)用次數(shù)；L：左側(cè)前肢（患側(cè)）獨立應(yīng)用次數(shù)；B：雙前肢同時應(yīng)用次數(shù)]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，顯示方差齊性的資料進(jìn)一步采用SNK檢驗作兩兩比較，若方差不齊用Dunnett’s檢驗。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測 假手術(shù)組及對照組的未缺血側(cè)大腦半球基本未見陽性細(xì)胞，而對照組的右側(cè)大腦半球皮質(zhì)缺血區(qū)可見胞質(zhì)呈棕黃色的SP免疫陽性細(xì)胞，在半暗帶區(qū)域及血管周圍尤其明顯。

2.2 大鼠腦梗死體積及腦組織含水量測定 藥物組及對照組大鼠腦梗死體積較假手術(shù)組明顯增加，藥物組與對照組比較，梗死體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。假手術(shù)組大鼠腦梗死體積和腦組織含水量均較對照組減少，藥物組與對照組比較腦組織含水量減少（P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠缺血再灌注后24h腦梗死體積和腦組織含水量的比較（%）

2.3 神經(jīng)行為學(xué)評估 轉(zhuǎn)棒試驗和肢體不對稱試驗結(jié)果均提示假手術(shù)組較對照組神經(jīng)行為功能明顯改善（P＜0.05），提示腦缺血再灌注造成大鼠神經(jīng)行為功能顯著損害；藥物組與對照組比較，大鼠神經(jīng)行為功能明顯改善（P＜0.05），見表2。

3 討論

在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注后缺血半暗帶區(qū)域SP免疫活性明顯增高，提示神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)在腦缺血中起作用，通過使用神經(jīng)激肽1受體拮抗劑抑制神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)使損傷大鼠腦組織含水量有所減少，神經(jīng)行為學(xué)功能得到改善，但腦梗死體積無明顯減小。

表2 3組大鼠缺血再灌注后轉(zhuǎn)棒試驗和肢體不對稱試驗結(jié)果的比較（%）

本實驗發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注24h后SP在腦組織缺血半暗帶區(qū)域活性明顯增高，在血管周圍尤其明顯。急性神經(jīng)系統(tǒng)損傷中關(guān)于神經(jīng)肽的報道較少，局限于周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷、脊髓損傷、腦缺血及腦外傷等。Donkin等[4]證實創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)源性炎癥的主要標(biāo)志物SP在損傷組織周圍表達(dá)增多，并且與血腦屏障損害、腦水腫及神經(jīng)功能損害顯著相關(guān)。Turner等[5]證實大鼠腦缺血再灌注24h時血管周圍組織、神經(jīng)膠質(zhì)組織、缺血半暗帶等區(qū)域SP免疫活性增加且其表達(dá)程度較梗死中心區(qū)明顯，而SP活性增加與腦水腫形成顯著相關(guān)，提示在腦梗死中神經(jīng)源性炎癥與腦水腫相關(guān)。一項創(chuàng)傷性腦損傷人群試驗發(fā)現(xiàn)1周內(nèi)死亡的患者經(jīng)過神經(jīng)病理學(xué)檢查證實患者皮質(zhì)中微血管P物質(zhì)免疫活性提高，血管周邊神經(jīng)元損傷后產(chǎn)生局部神經(jīng)肽釋放繼而血管通透性增加導(dǎo)致水腫[6]。另外在腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作及腦外傷人群中均有發(fā)現(xiàn)其血清SP水平增高的報道。也有研究證實腦組織SP活性增高但僅發(fā)生于可逆性缺血而非永久性缺血，提示再灌注損傷在引發(fā)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的必要性[7]。

本實驗發(fā)現(xiàn)神經(jīng)激肽1受體拮抗劑使腦缺血再灌注后24h腦組織含水量減少，證實了SP介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)和血管源性水腫在腦缺血后腦水腫形成中的作用。Donkin等[4]首次證實了神經(jīng)激肽1受體拮抗劑可減輕大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后血腦屏障通透性和腦水腫形成，并減輕神經(jīng)功能損害。Turner等[8]證實在短暫性腦缺血再灌注試驗中神經(jīng)激肽1受體拮抗劑減輕了再灌注24h時腦水腫程度。除了使用神經(jīng)激肽1受體拮抗劑，有學(xué)者證實可利用神經(jīng)肽清除的方法顯著減輕創(chuàng)傷后早期血腦通透性[9]，也推斷血管源性水腫是細(xì)胞毒性水腫的前提。因此我們猜想抑制神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)可成為治療梗死后腦水腫的新途徑。

本實驗利用轉(zhuǎn)棒試驗及肢體不對稱試驗評估大鼠腦缺血后神經(jīng)行為學(xué)，發(fā)現(xiàn)改善了腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷，但腦梗死體積無明顯減少，提示梗死體積并非決定腦梗死后神經(jīng)功能的唯一因素，而神經(jīng)突觸的可塑性與連接性對提高有效神經(jīng)功能具有重要意義，神經(jīng)激肽1受體拮抗劑是否有該作用有待進(jìn)一步考證。

[1]Black P H．Stress and the inflammatory response:a review of neurogenic inflammation[J]．Brain Behav Immun,2002,16(6): 622-653．

[2]Severini C,Improta G,Falconieri-Erspamer G,et al．The tachykinin peptide family[J]．Pharmacol Rev,2002,54(2):285-322．

[3]Gartshore G,Patterson J,Macrae I M．Influence of ischemia and reperfusion on the course ofbrain tissue swelling and blood-brain barrier permeability in a rodent model of transient focal cerebral ischemia[J]．Exp Neurol,1997,147(2):353-360．

[4]Donkin J J,Nimmo A J,CernakI,et al．Acritical role for substance P in the development of traumatic brain edema[J]．J Cereb Blood Flow Metab,2009(8):1388-1398．

[5]Turner R J,Blumbergs P C,Sims N R,et al．Increased substance P immunoreactivity and oedema formation following reversible ischemic stroke[J]．ActaNeurochir,2006,Suppl,96:263-266．

[6]Zacest A C,Vink R,Manavis J,et al．Substance P immunoreactivity increases following human traumatic brain injury[J]．Acta Neurochir,2010,Suppl,106:211-216．

[7]Fu D,Ng Y K,Gan P,et al．Permanent occlusion of the middle cerebral artery upregulates expression of cytokines and neuronal nitric oxide synthase in the spinal cord and urinary bladder in the adult rat[J]．Neuroscience,2004,125(4):819-831．

[8]Turner R J,Vink R．Inhibition of neurogenic inflammation as a novel treatment for ischaemic stroke[J]．Drug NewsPerspect,2007, 20(4):221-226．

[9]Nimmo A J,Cernak I,Heath D L,et al．Neurogenic inflammation is associated with development of edema and functional deficits following traumatic brain injury in rats[J]．Neuropeptides,2004, 38(1):40-47．

Neuroprotective effects of neurokinin1 receptor antagonist on cerebral ischemia-reperfusion in rats

Objective To investigate the neuroprotective effects of neurokinin1 receptor antagonist on cerebral ischemia-reperfusion in rats．Methods Fifty four rats were randomly assigned to medication group,sham-operation group and control group with 18 animals in each group．Cerebral ischemia was induced using a reversible thread model of middle cerebral artery occlusion．The expression of substance P was observed by immunohistochemistry．Volume of brain infarction was calculated by TTC stain and edema formation was determined by wet weight-dry weight method．Neurological outcome was assessed using the rotarod test and asymmetry test．Results Immunohistochemistry revealed increase of SP following ischemia-reperfusion．Compared to control group the brain water content and neurological function impairment were attenuated in medication group, but the infarction volume was not reduced． Conclusion Neurokinin1 receptor antagonist may attenuate ischemia-reperfusion injury through inhibition of neurogenic inflammation．

Ischemia-reperfusion Substance P Brain edema Neurogenic inflammation

2012-02-21）

（本文編輯：楊麗）

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目2012B003

310006 杭州市第一人民醫(yī)院老年科

高越，E-mail：gy9821@sina.com