張崢程 張治芬

●論 著

超排卵周期中卵泡不同反應(yīng)組鈣粘素的表達(dá)研究

張崢程 張治芬

目的 研究超排卵周期中卵巢不同反應(yīng)組患者的卵泡液E-cadherin、N-cadherin、雌二醇、孕酮的表達(dá)及相互關(guān)系。 方法 對(duì)70例因輸卵管、男性因素不孕患者行體外受精-胚胎移植，按取卵時(shí)卵泡發(fā)育數(shù)目不同分為低反應(yīng)組、高反應(yīng)組及正常反應(yīng)組。用ELISA法及CL法分別測(cè)定各組卵泡液中E-cadherin、N-cadherin、雌二醇、孕酮水平，并作比較分析。 結(jié)果 高反應(yīng)組N-cadherin顯著高于正常反應(yīng)組（P＜0.05）。低反應(yīng)組E-cadherin顯著高于正常反應(yīng)組（P＜0.05）。低反應(yīng)組FSH用量明顯高于正常反應(yīng)組及高反應(yīng)組（P＜0.05），且與E-cadherin呈正相關(guān)。高反應(yīng)組雌二醇水平明顯高于其余各組（P＜0.05），低反應(yīng)組孕酮水平明顯高于其余各組（P＜0.05）。 結(jié)論 高反應(yīng)組患者卵泡群發(fā)可能與卵泡局部N-cadherin的高表達(dá)有關(guān)，而低反應(yīng)組卵泡發(fā)育受阻可能與高E-cadherin水平有關(guān)，使卵泡對(duì)FSH反應(yīng)性降低并有黃素化傾向。

鈣粘素 卵泡 顆粒細(xì)胞 卵泡液 性激素

卵泡發(fā)育過(guò)程、機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。卵泡被募集或被選擇形成優(yōu)勢(shì)卵泡或閉鎖，其具體機(jī)制尚不明確。顆粒細(xì)胞的增殖、分化、相互作用，顆粒細(xì)胞與卵母的關(guān)系都借助于細(xì)胞粘附，細(xì)胞間的相互黏附、信息表達(dá)、溝通影響著細(xì)胞的相互作用。鈣粘素（cadherin）是其中主要黏附分子，但黏附分子在卵泡發(fā)育中的作用尚知之甚少。目前，關(guān)于cadherin與卵泡發(fā)育之間關(guān)系的研究主要局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，相關(guān)研究亦不多。本研究通過(guò)觀察卵泡不同反應(yīng)患者cadherin的表達(dá)情況，旨在探討cadherin在卵泡發(fā)育中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2007-10—2009-05在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院因輸卵管性不孕或男性因素不孕而行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）者70例。根據(jù)給予超排卵周期方案后取卵時(shí)平均直徑＞14mm的卵泡數(shù)目的不同進(jìn)行分組，卵泡數(shù)≤5個(gè)為卵巢低反應(yīng)組（低反應(yīng)組），卵泡數(shù)6～20個(gè)為正常反應(yīng)組，≥21個(gè)為卵巢高反應(yīng)組（高反應(yīng)組）。3組患者的一般資料見(jiàn)表1，其年齡及不孕時(shí)間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 3組患者的一般資料

1.2 超排卵周期方案 所有患者均行基礎(chǔ)激素水平測(cè)定，包括基礎(chǔ)促卵泡激素（bFSH）。常規(guī)體外受精或卵胞漿內(nèi)單精子注射的患者促排卵采用長(zhǎng)周期方案，在促排卵周期的前1個(gè)月經(jīng)周期測(cè)基礎(chǔ)體溫，當(dāng)基礎(chǔ)體溫上升后第7天，即在黃體高峰期起每天皮內(nèi)注射短效促性腺激素釋放激素類(lèi)似物（GnRHa），在下1個(gè)月經(jīng)周期第3天始肌注重組FSH促卵泡發(fā)育，周期第8天開(kāi)始行B超下卵泡監(jiān)測(cè)；當(dāng)最大卵泡平均直徑達(dá)18mm或有3個(gè)卵泡平均直徑達(dá)16mm時(shí)停用FSH，并在停用36h后肌肉注射絨毛膜促性腺激素（HCG）10 000U，36h后行陰道B超下取卵術(shù)。記錄每例患者的FSH使用劑量。

1.3 標(biāo)本采集和處理 留取澄清不帶血卵泡液（取卵時(shí)選擇卵泡直徑1.8～2.0cm的卵泡）經(jīng)3 000r/min離心10min后，取上清液-70℃貯存待測(cè)。

1.4 卵泡液檢測(cè) 檢測(cè)卵泡液上皮型 cadherin（E-cadherin）及神經(jīng)型cadherin（N-cadherin）水平、雌二醇、孕酮水平。采用酶聯(lián)免疫分析儀（德國(guó)拜爾公司制造）檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin，ELISA試劑盒購(gòu)自USCN LIFE公司。采用免疫化學(xué)發(fā)光法測(cè)定雌二醇、孕酮均，在全自動(dòng)免疫分析儀（ACS：180SE，德國(guó)拜耳公司），試劑盒由該公司提供。所有標(biāo)本均為同批檢測(cè)，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，各項(xiàng)質(zhì)控均符合要求。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSSl7.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)均以 表示，組間比較采用方差分析，相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

3組患者各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的比較見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，低反應(yīng)組bFSH明顯高于正常反應(yīng)組、高反應(yīng)組（P＜0.05）。低反應(yīng)組FSH用量明顯高于正常反應(yīng)組及高反應(yīng)組（P＜0.05），且FSH用量與E-cadherin存在正相關(guān)性（P＜0.05）。高反應(yīng)組N-cad-herin顯著高于正常反應(yīng)組及低反應(yīng)組（P＜0.05）。低反應(yīng)組E-cadherin明顯高于正常反應(yīng)組（P＜0.05）。高反應(yīng)組雌二醇水平明顯高于其余各組（P＜0.05）。低反應(yīng)組孕酮水平明顯高于其余各組（P＜0.05）。

表2 3組患者各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的比較

3 討論

黏附分子是位于細(xì)胞表面或細(xì)胞基質(zhì)中的糖蛋白，使細(xì)胞與細(xì)胞間以及細(xì)胞與基質(zhì)間發(fā)生黏附，參與細(xì)胞的識(shí)別、活化和信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞增殖與分化、伸展與運(yùn)動(dòng)是免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過(guò)程的分子基礎(chǔ)。不同黏附分子在體內(nèi)有其獨(dú)特的組織分布，其表達(dá)隨細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)的不同而不同。cadherin是細(xì)胞黏附分子的一種，至今已鑒定出30種以上，主要有E-cadherin（CD324/CDH1）、N-cadherin（CD325/CDH2）等。卵泡在生理周期發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)出不同類(lèi)型的cadherin的時(shí)空表達(dá)變化。卵泡顆粒細(xì)胞間的相互作用是影響細(xì)胞分化、卵泡發(fā)育，導(dǎo)致卵泡排卵或選擇閉鎖的重要因素。

N-cadherin在各卵泡階段顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，早、中期黃體均有強(qiáng)烈表達(dá)[1]。N-cadherin涉及細(xì)胞間黏附和組織形態(tài)發(fā)生，也參與信號(hào)轉(zhuǎn)換，以影響各種細(xì)胞功能。N-cadherin胞外區(qū)域和成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）受體的結(jié)構(gòu)相似（兩者含有共同的保守HAV區(qū)域），而bFGF能影響原始卵泡向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)化。在原始卵泡階段，卵母細(xì)胞分泌堿性bFGF和生長(zhǎng)分化因子-9以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15等，由此促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖[2-3]。另外，N-cadherin相互結(jié)合啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，經(jīng)cAMP途徑可抑制顆粒細(xì)胞凋亡，調(diào)控卵泡閉鎖，維持、促進(jìn)了卵泡生長(zhǎng)發(fā)育[4-5]。同時(shí)，N-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞接觸可使顆粒細(xì)胞表面G蛋白配體與G蛋白相關(guān)受體結(jié)合影響cAMP[6]，刺激、激活信號(hào)瀑布級(jí)聯(lián)，卵母細(xì)胞表面的FGF受體激活以防止生發(fā)泡破裂，阻滯減數(shù)分裂[7-8]。卵泡的成熟主要受垂體分泌的FSH和LH通過(guò)顆粒細(xì)胞介導(dǎo)調(diào)控，F(xiàn)SH和LH的作用很大程度上取決于cAMP依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，cAMP信號(hào)通路參與了卵巢卵泡生長(zhǎng)的啟動(dòng)與發(fā)育。本研究結(jié)果提示，高反應(yīng)組N-cadherin高于正常反應(yīng)組及低反應(yīng)組，可能與N-cadherin升高，通過(guò)堿性bFGF系統(tǒng)及第二信使cAMP信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，激發(fā)大量的卵泡啟動(dòng)，對(duì)FSH產(chǎn)生應(yīng)答，誘導(dǎo)眾多卵泡迅速發(fā)育，造成卵泡過(guò)度刺激綜合征。由此推測(cè)，超促排卵中多囊卵巢綜合征（PCOS）大量卵泡的啟動(dòng)發(fā)育也可能與之有關(guān)。

原始卵泡發(fā)育完成后顆粒細(xì)胞表達(dá)包括FSH、GnRH、糖皮質(zhì)激素和雌激素等受體，成為對(duì)激素具應(yīng)答能力的初級(jí)卵泡，因此激素與卵泡的啟動(dòng)無(wú)關(guān)。E-cadherin在始基卵泡和早期初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞表達(dá)。隨著始基卵泡生長(zhǎng)發(fā)動(dòng)，E-cadherin首先在卵細(xì)胞，隨后在顆粒細(xì)胞表達(dá)消失，cadherin在始基卵泡的表達(dá)變化提示E-cadherin可能參與早期卵泡生長(zhǎng)始動(dòng)的調(diào)節(jié)[1，9]。本研究結(jié)果提示，卵泡液E-cadherin在低反應(yīng)組明顯高于正常反應(yīng)組，低反應(yīng)組基礎(chǔ)促性腺激素水平高于正常反應(yīng)組及高反應(yīng)組，卵泡儲(chǔ)備功能差，超促排卵中FSH的用量也明顯高于其他兩組，F(xiàn)SH用量與E-cadherin存在一定正相關(guān)。推測(cè)可能是高E-cadherin水平使卵泡一直處于早期卵泡狀態(tài)，抑制了卵泡的發(fā)育，表現(xiàn)為對(duì)FSH刺激呈現(xiàn)低反應(yīng)性。導(dǎo)致E-cadherin在低反應(yīng)組中遲遲不降的原因及機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

Peluso等[10]及Machell等[11]的研究結(jié)果顯示，未成熟大鼠在促性腺激素治療下顆粒細(xì)胞E和N-cadherin的表達(dá)類(lèi)似于性成熟生殖周期中大鼠。促性腺激素所致的黃素化顆粒細(xì)胞N-cadherin表達(dá)略有減少；而E-cadherin的表達(dá)又始于卵泡黃素化，這兩種鈣粘素在黃體完全形成時(shí)呈顯著表達(dá)。本研究結(jié)果提示，低反應(yīng)組卵泡液E-cadherin及孕酮水平均明顯高于正常反應(yīng)組、高反應(yīng)組，孕酮水平的偏高提示卵泡有局部黃素化表現(xiàn)。Luborsky等[12]也發(fā)現(xiàn)，在低反應(yīng)組卵泡液中孕酮顯著高于正常反應(yīng)組，并且其他一些黃素化指標(biāo)如VEGF、抑制素A、抑制素A/抑制素B的比值也在低反應(yīng)組顯著升高?？梢?jiàn)卵巢對(duì)促性腺激素低反應(yīng)與卵泡過(guò)早黃素化有關(guān)，這可能是低反應(yīng)組獲卵率低的原因之一。但本研究未發(fā)現(xiàn)E-cadherin的表達(dá)與孕酮的分泌具有直接相關(guān)性。Lu等[13]認(rèn)為，含過(guò)熟卵丘復(fù)合物OCCC組卵泡液中孕酮水平顯著低于成熟、未成熟組，提出排卵前卵泡液中高孕酮水平有助于卵母細(xì)胞成熟成長(zhǎng)。低反應(yīng)組中孕酮的變化及意義有待于更多的研究證據(jù)。

E-cadherin在體外未成熟大鼠顆粒細(xì)胞中的表達(dá)受E2的影響[14]，而體內(nèi)雌激素治療可提高未成熟小鼠卵巢E-cadherin和N-cadherin mRNA的表達(dá)。由此推測(cè)，激素是調(diào)節(jié)E-cadherin、N-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞相互作用的一個(gè)重要的因子[15]。但本研究結(jié)果顯示，低反應(yīng)組孕酮與E-cadherin均有顯著升高，高反應(yīng)組雌二醇與N-cadherin均明顯升高，但孕酮與E-cadherin、N-cadherin，雌二醇與E-cadherin、N-cadherin間均無(wú)明顯相關(guān)性，其相互作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。Farookhi等[16]發(fā)現(xiàn)，E2與FSH能刺激分離的大鼠顆粒細(xì)胞中N-cadherinmRNA的表達(dá)，但不影響聚合顆粒細(xì)胞N-cadherin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。本研究結(jié)果提示，盡管卵泡顆粒細(xì)胞受不同劑量FSH刺激，但未呈現(xiàn)出N-cadherin表達(dá)量的相關(guān)性變化，而E-cadherin與FSH呈正相關(guān)。也有研究報(bào)道，F(xiàn)SH可修正胚胎原始卵泡形成受損相關(guān)的N-cadherin mRNA表達(dá)減少及E-cadherin mRNA表達(dá)增加[17]。這種表達(dá)的改變可被絨毛膜促性腺激素逆轉(zhuǎn)。本研究中低反應(yīng)組FSH用量最大，與各組有顯著差別，絨毛膜促性腺激素使用各組劑量無(wú)差異而E-cadherin表達(dá)增加仍然存在，N-cadherin表達(dá)較正常反應(yīng)組未見(jiàn)減少，可見(jiàn)常規(guī)劑量絨毛膜促性腺激素不能逆轉(zhuǎn)E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)改變。綜上所述，卵泡的發(fā)育機(jī)制復(fù)雜，其中顆粒細(xì)胞間、顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間的相互關(guān)系非常重要，而黏附分子是其中關(guān)鍵之一，進(jìn)一步研究顆粒細(xì)胞間、顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間相互關(guān)系及作用機(jī)制，探討卵泡發(fā)育機(jī)制，對(duì)了解病理過(guò)程的發(fā)生及探索治療具有極大的臨床意義。

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The expression of cadherin in various follicles reactive groups during superovulation cycle

ZHANG Zhengcheng，ZHANG Zhifen.Wom-

en's Hospital School of Medicine Zhejiang University，Hangzhou 310006,China

【 Abstract】Objective To investigate the levels of E-cadherin,N-cadherin,estradiol,progesterone in human follicular fluid(FF)and its association with different responses to ovarian stimulation. Methods Enzyme-linked immnosorbent assay(ELISA) was performed to determine the levels of E-cadherin,N-cadherin in FF obtained from follicle aspirates in 70 patients undergoing IVF treatment,and chemiluminescence (CL)method was performed to determine the levels of estradiol,progesterone in FF.According to the response to ovarian stimulation the patients were divided into poor responder group(PRG),high responder group（HRG）and normal responder group（NRG）.Results N-cadherin levels in FF of HRG were significantly higher than those in NRG and PRG(P＜0.05)，E-cadherin levels of PRG were significantly higher than those in NRG、HRG(P＜0.05)．FSH dosages of PRG were significantly higher than those in NRG and HRG (P＜0.05)．There was a positive correlation between the FSH dosages and the E-cadherin levels.Estradiol levels in FF of HRG were significant higher than those of other two groups(P＜0.05).Progesterone levels of PRG were significantly higher than those in other two groups(P＜0.05). Conclusion Increased levels of N-cadherin in FF may be associated with the a large number of follicular development in high response to ovarian stimulation.Increased levels of E-cadherin in FF may be associated with the blocked follicular development in PRG,which suggests that the follicles were not sensitive to the stimulation of FSH and there is a tendency to luteinized with the rising of progesterone.

Cadherin Follicular Granulosa cells Follicular fluid Sex hormones

2012-08-15）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

浙江省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金項(xiàng)目（2008A17）；浙江省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009C33114）

310006 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院（張崢程系解放軍第117醫(yī)院婦產(chǎn)科在職研究生）；杭州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（張治芬）

張治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn